RNAseq文库制备:从细胞到cDNA

 

RNAseq文库

 

RNAseq文库,也称全转录组散弹枪测序文库,提供细胞进程的快照,使研究人员能够获得有关转录组在环境变化、疾病期间或药物应用后的变化的信息。RNAseq文库还允许检测mRNA剪接变体和SNPs。RNAseq文库几乎取代了微阵列,因为微阵列需要一个已知的模板。众所周知,微阵列在检测和定量低丰度和高丰度RNAs以及生产人工制品方面也是不可靠的。

 

构建RNAseq文库的过程取决于所使用的平台。然而,一般来说,所有这些文库都是通过以下步骤获得的。RNAseq文库准备的成功依赖于每个阶段的精心控制,本文介绍创建RNAseq文库的前两个阶段(步骤1- 3)。

 

1)RNA分离

2)RNA片段化

3)反转录

4) cDNA高通量(下一代)测序

5) in silico序列比对

 

  1. 起始物的准备

 

与任何大规模、多阶段的实验一样,起始材料的质量至关重要。对于细胞培养,大多数细胞应该处于相同的生长阶段。对于组织特异性基因表达,应最大限度地从其他组织类型中纯化组织。

 

细胞应尽快收获,并尽量减少渗透、温度等冲击。在液氮中快速冷冻和研磨得到的粉末是获得损伤最小的核酸的首选方法。

 

如果使用RNAseq来评估药物效果,那么初步实验应该确定有效剂量。如果药物浓度过低,与对照样本相比,不能注意到转录差异;药物浓度过高的话,细胞就会停止mRNA的生产。例如,环己酰亚胺,经典的真核蛋白翻译抑制剂,其在体内蛋白合成和RNA合成的IC50分别为532.5 nM和2880 nM。

 

  1. RNA分离

 

与任何涉及RNA的实验一样,需要格外小心以避免RNA降解。在高温烘箱中对所有玻璃器皿进行高压消毒,以减少RNA酶污染的机会。所有的缓冲液都应该含有RNA酶抑制剂。使用认证的无RNA酶的塑料和DNA酶。净化工作环境,且一定要戴手套。

 

用自己常用的方法从组织中提取RNA,例如用trisol。RNA提取后,电泳检测RNA完整性至关重要,最好是毛细管检测。由RIN算法确定的RNA完整指数会告诉你是继续实验还是重新开始,因为处理降解的RNA是没有意义的。RIN从10(完整)到1(完全降解),7以下的样品不能使用。

 

  1. RNA的选择

 

如果样本通过了完整性测试,即得到了总RNA。下一步是去除你不想要的RNA类型,用你需要的RNA类型丰富你的样本。首先去除rRNA,因为它占总RNA的90%,会淹没任何信号。最简单的方法是使用rRNA去除试剂盒。

 

消除rRNA后,如果你对总转录水平感兴趣,可以直接进行cDNA合成,否则将需要进一步缩小目标。进一步的RNA类型选择需要额外的步骤:

 

A.要分离成熟的mRNA,可以使用与附在珠子上的poly(T)寡聚体结合的polyA tails。该方法适用于mRNA剪接变异的检测。

B.分离小RNA,如miRNA,通过凝胶过滤或亲和层析进行大小选择。

C.通过定制探针杂交捕获特定RNAs。

 

  1. cDNA的合成

 

DNA合成可能是最简单的步骤,如果RNA样本是高质量的。使用3 '或5 ' DNA连接物与RNA杂交,启动逆转录。用RNAse去除模板。cDNA已经准备好使用下一代测序平台进行测序。尽管cDNA合成步骤是最简单的,但由于选择性的cDNA扩增,它会引入偏差。知道这种可能性,可以使用相应的对照。

 

 

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