避免影响限制性酶切反应效果的因素，教你轻松搞定DNA限制性内切酶反应！
自20世纪70年代以来，使用限制酶来表征DNA的方法一直很受欢迎。如今，这种技术仍然是评估DNA序列最简单、最快的方法之一。与大多数实验室试剂一样，限制性内切酶可能是变化无常的。无论你是简单地消化一个质粒，还是执行复杂的克隆或筛选程序，都需要考虑几个主要的因素:
- 正确的使用条件
每一种酶都是不同的，需要特定的条件，例如:
BSA是许多限制性酶的稳定剂；有些酶不能长时间工作超过1-2个小时
大多数限制性酶在pH 7.2和pH 8.5之间有效地消化，使用合适的缓冲液很重要。
大多数商业供应商都有他们自己选择和使用限制性内切酶的特别指南，使用前应了解清楚。
在双重限制性酶消化时，如果两种酶的最佳条件不同，你可能需要部分地牺牲一种酶的活性。在分析结果时要考虑这一点。或者，可以进行连续的消化，先使用第一种酶，凝胶提取去除缓冲液组分，然后用第二种酶消化。如果使用这种方法，开始用多个管子进行相同反应可能是明智的，因为在凝胶提取过程中，可能会丢失很多材料。
- 甲基化作用
当细菌复制一个质粒时，它们通常将特定的CpG岛甲基化。这些序列通常是甲基化的目标。 限制性酶切位点也可能由于与甲基化位点有重叠而无法切割。此时，限制性内切酶位点与旁侧的序列恰巧组成Dam或者Dcm识别位点，并进而被甲基化而阻断切割。因此在质粒构建设计酶切位点时，要充分考虑到这种情况。
在实验室大肠杆菌菌株中有三种不同类型的甲基化酶: Dam甲基化酶、Dcm甲基转移酶和EcoKI甲基化酶。如果你想要消化一个可能被甲基化的限制位点，你可以使用一个甲基化无能力的大肠杆菌菌株(JM11)来繁殖你的质粒。这些大肠杆菌菌株无法甲基化DNA，从而你的限制性酶可以裂解CpG岛。
- 星活性最小化
一些限制酶在特定的条件下，它们可能会变得杂乱，随机消化DNA，而不是在特定的识别位点。这种现象被称为星活性，通常是由长时间的潜伏期或缓冲条件不佳(如pH)引起的。因此，使用所需的酶与推荐的缓冲液是至关重要的。
此外，高甘油浓度可能会导致星活性增加。由于大多数酶和它们的缓冲液都被包装成甘油来延长保质期，所以你应该充分稀释缓冲液和酶。这也是为什么许多公司在他们的通用步骤建议20 - 50µl反应体系和提供10 x缓冲液。
- 给你的酶一些空间
某些酶在识别位点两边有几个碱基对时效率最高。如果你要用双切，两种酶位置比较紧密，或者消化PCR产物的末端时，这一点尤其重要。
每个制造商对他们的产品都有具体的建议，但通常建议确保在识别位点的两边至少有6个碱基对。添加更多碱基对的最简单方法是通过PCR引物进行设计。尽量避免带有引物二聚体形成风险的序列。
- 同裂酶和异裂酶
有时你需要使用一种特殊的酶，它的最佳条件并不适合你的实验设置。在这种情况下，同裂酶可能会帮助你进行你的实验，而不会严重影响你的最终结果。
同裂酶是两种能识别相同的位点，但具有不同性质的限制性酶，通常来自不同的细菌体系。例如，SinI 和AvaII 都都识别序列G / G(A或T)CC。然而，AvaII是甲基化敏感的，而SinI不是。因此，如果你想要切断这个序列，并且不想使用甲基化不敏感的大肠杆菌菌株，那么SinI可以满足条件，而AvaII则不会。
两种酶具有相同的识别位点，但在不同的碱基对上切割被称为异裂酶。这可能有助于避免星活性和甲基化敏感性。例如， KpnI和Acc65I都识别这个位点:GGTACC，但在不同的位置切割。KpnI切割bp 5:GGTAC / C，而Acc65I切割bp 1:G / GTACC。KpnI可能会显示出星活性，而Acc65I则更强健。因此，如果切割位置不重要，Acc65I可能是一个更好的选择。
