免疫组化困难重重？这篇文章，你一定得看

很多客户向小编抱怨免疫组化中总出现假阳性，很是头疼。小编是很善良的，特意给你们找来了师兄师姐们总结的经验。不用客气，只管往下看：

1.消除内源酶的影响

在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。
通常情况下，去除内源酶的方法是先用 3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在 OCT 包埋的冰冻切片中，使用 3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用 3%的过氧化氢甲醇溶液孵育 20 分钟的方法灭活内源性酶。
灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素） - 生物素复合物，导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。

2. 消除非特异性背景着色

非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清，是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。
用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用，产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂，更易造成背景染色。稀释液采用含 1%BAS pH7.4 的 PBS ，同时在洗液中加入 0.05%的吐温 20 （ Tween20 ）有助于消除背景染色。

3. 消除病理性色素的影响

当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止其与 DAB 显色呈现的黄褐色发生混淆，最好选用 AEC 显色剂。组织固定时间过长时，切片中容易产生福尔马林色素颗粒，影响结果观察，取材时应充分用流水冲洗，以消除影响。

切片制作不当引起的非特异性着色 在严重变性、坏死及炎性病灶处，在胶原纤维和结缔组织部位，在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体；有的机理不明；有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关，解决的办法是在滴加一抗前，以二抗动物的正常血清（ 5 %~10 %）封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。

4. 清洗不充分而造成的非特异性着色

应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐，其有利于减低背景着色，通常使用 0.05mlo/L PBS ，溶液内加入吐温 20 ，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外，在清洗后至加入下一步试剂前，不能干片，干片的部位会出现非特异着色。

DBA 显色产生的某些背景颜色 使用浓缩型 DAB 试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸镏水的 pH 值，以确保实验结果的正确性。粉剂 DBA 溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去。否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外， DAB 保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将 DAB 保存于避光干燥处，现用现配，临用前加 H2O2。