肥大细胞(MC)是介导过敏反应发生的关键因子。经典的MC脱颗粒通路是由FcεRI聚合来介导的,而且不同种属间的作用强度各不相同。然而最近有一篇报道显示,一种非经典的,类似伪过敏作用的借助MRGPRX2的作用而发生。然而,很少疗法可以直接针对伪过敏同时和Mrgprs相关。异亮氨酸苷元(ISL)在多种疾病中发挥着抗炎作用。在本研究中,我们研究了ISL的抗伪过敏作用及其潜在机制。首先我们在体外培养MCs,并建立PCA模型,用来检测了ISL对IgE介导免疫应答的影响。
进一步,我们利用HEK293细胞体外表达MRGPRX2来评价其抗伪过敏作用是否与MRGPRX2相关。ISL剂量依赖性地抑制化合物48/80 (C48/80)诱导的小鼠PCA和MC脱颗粒。我们的体外研究表明,ISL能降低C48 /80诱导的钙通量,并且抑制LAD2细胞的脱颗粒作用。ISL剂量依赖性地抑制了C48 /80诱导mrgprx2表达地HEK293细胞活化。我们地结论是ISL可以通过Mrgprx2通路抑制IgE介导的过敏反应,这为伪过敏及其治疗提供了一个新的视角。
全身性过敏反应是一种严重的、危及生命的超敏反应,通常表现为许多不同的症状,包括血管性水肿、呼吸急促、耳鸣和心律失常。肥大细胞(MCs)是过敏反应的主要效应因子,主要位于暴露于外部环境的部位,如皮肤、呼吸道和口腔/胃肠粘膜。MCs含有分泌囊泡,含有大量具有多种生物活性的分子。它们可能通过释放组胺(HA)、蛋白酶、前列腺素、白三烯和细胞因子等储存或最新合成的炎症介质,在炎症和过敏反应中发挥重要作用。HA长期以来被认为是过敏反应的重要介质,是MCs释放的第一介质,具有平滑肌收缩、血管舒张、血管通透性增加、粘液分泌、痛觉神经元受体活化等多种病理生理活性。
广义上,MCs通过交联抗原特异性 IgE受体(FcεRI),导致预合成和最新合成的介质释放,从而介质诱导MC脱粒。尽管通过FcεRI聚合而导致的过敏反应MC脱粒发生聚合,而且不同主体间的强度不一样,最近发现一个类似的伪过敏途径是通过MRGPRX2发生的。配体包括各种药物,抗菌肽和神经肽,如P物质(SP),使受体相当普遍。这些配体直接刺激MRGPRX2,而不需要诸如IgE这样的中介。
到目前为止,还没有完全治愈过敏性疾病的疗法。抗ha药物、MC稳定剂、免疫抑制剂等药物只能缓解过敏症状,减轻过敏反应带来的痛苦;此外,这些药物有一些副作用。
ISL是从光果甘草,乌拉尔甘草和胀果甘草的根和茎中分离得到的查尔酮。甘草苷元作为一种替代药物应用于普通食品中,其衍生物ISL作为一种食品添加剂使用。其他已报道的药理特性包括抑制癌细胞生长,抗炎和抗氧化活性。2007年,Lee等人提出,ISL通过抗炎作用在高血清IgA小鼠中观察到的抗肾炎作用,可以部分归因于ISL对血小板来源的生长因子受体酪氨酸激酶的特异性抑制。然而,目前还没有关于ISL在单独IgE介导的过敏反应中的作用的报道。本研究的目的是确定ISL的体内外抗假过敏作用。
分子对接在药物发现中有着广泛的用途和应用,包括通过虚拟药物筛选寻找潜在的配体。分子对接实验结果表明,ISL通过氢键相互作用与MRGPRX2受体蛋白结合。球空间场模型(图1A)表明,ISL在MRGPRX2的活性腔内具有良好的拟合性。进一步分析ISL与MRGPRX2的相互作用(图1B), ISL的三个羟基分别与PHE147、CYS155、ASP159形成三个氢键(键长分别为1.95 A、2.22 A、1.93 A)。
此外,细胞计数和细胞凋亡的结果显示,12 h与不同浓度的ISL处理(12.5、25和50μM)没有细胞毒性效应,而100 μM和200 μM ISL处理的LAD2细胞表现出轻微的不良影响(图1C和D)。
我们没有观察到细胞ISL治疗后,LAD2或MRGPRX2表达的HEK293细胞内Ca2+离子浓度的增加,这表明ISL并不影响HEK293细胞内LAD2的激活和MRGPRX2表达 (图1 E和F)。此外,ISL处理没有诱导LAD2细胞体外脱粒,以及对LAD2细胞β-己糖胺酶和HA的释放没有可检测到的影响(图1 g和H),表明ISL对LAD2细胞的脱粒可能表现出抑制作用。
图1所示。ISL是一种潜在的MRGPRX2拮抗剂。(实验至少重复三次。数据以平均mean ± S.E.M.表示,并分析了两个配对的未配对t检验。(A-B)通过分子对接实验观察到ISL与MRGPRX2蛋白受体结合。ISL的3个羟基与PHE147、CYS155、ASP159形成3个氢键,键长分别为1.95 A、2.22 A、1.93 A。(C) ISL对LAD2细胞无细胞毒作用。(D) ISL未诱导LAD2凋亡。(E F) 50微摩尔ISL不能激活LAD2细胞或表达HEK-293的mrgprx2细胞,增加细胞内钙离子(Ca2+)浓度。(G-H) ISL未能诱导LAD2细胞脱粒和β-hexosaminidase和组胺的释放。C48/80(30μg /毫升)作为积极的控制,和Tyrode年代的解决方案是使用空白的控制。