原理:细胞增殖能力是评价细胞活性、代谢、生理、病理状况、基因毒性和抗肿瘤药物效果等的重要指标之一。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷,是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine)类似物,它可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。
据报道,作为BrdU的替代物,EdU在DNA复制过程中很容易掺入到细胞DNA中,并在细胞核中积累。EdU的成功结合代表了炔基标签足够小的益处。另一方面,EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通过一价铜离子(由还原剂维生素C还原Cu2+所得)的催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction)。
图(A) EdU标记细胞中的DNA及反应原理图
优势:
(1)采用传统的免疫荧光染色(BrdU)检测细胞增殖的方法需要DNA变性,抗原修复,抗原抗体过夜孵育,操作步骤过多且复杂。
由于BrdU抗体分子较大,嵌入DNA分子中的BrdU无法直接与BrdU抗体结合,必须先进行DNA变性操作才能使BrdU抗原表位暴露,但变性的程度可能导致错误结果。
如果变性不充分,会导致BrdU难以暴露,无法检测,而且变性过程从边缘向中间渗透,会导致细胞核DNA的变性不均匀,边缘模糊不清。如果变性过分,则会导致DNA断裂,甚至降解,导致核染不均一。
另外,不同抗体试剂公司的抗体质量不一致,以及所使用的抗体有时会和其它目的蛋白基于抗体的检测相互产生干扰,造成难以确保实验重复性,且容易产生假阳性结果,其影响因素较多,稳定性比较差。
与BrdU方法相比,EdU检测细胞增殖方法不需要DNA变性,不需要抗原修复,不需要抗原抗体反应。
(2)EdU细胞增殖方法简单,灵敏,方便,快速,准确,无需DNA变性,能够与各种抗体或荧光蛋白同时标记,以检测细胞其他性状特征,是细胞增殖检测的最佳选择。
(3)EdU细胞增殖检测可以直接并准确地检测出新DNA的合成。这种检测不仅能够测定单个细胞的增殖,还可以通过任何平台检测出细胞、组织或整个有机体中的增殖细胞。
图(B) EdU与荧光叠氮化物探针Azide Alexa Fluor 488结合
