样本采集和血液处理中需要考虑6个要点!
microRNA (miRNA) 在疾病生物标志物发现中作为循环生物标志物的引领者。对循环miRNA的大力宣传是必要的,它们符合一个良好生物标志物的许多标准,即在某些病理条件下,血液循环的稳定性和水平的变化。最近的研究表明,miRNAs可能是癌症、心肌梗死、动脉粥样硬化和神经退行性疾病的有用标志物。
miRNAs在血液中并不是独立存在的,相反,它们会与Argonaute2蛋白、脂蛋白或在细胞外囊泡,以复合物的形式循环,这些相互作用解释了它们在循环中的稳定性。然而,样品的收集和制备可以影响这些复合物的组成,因而影响提取的方法。以下是样本采集和血液处理中需要考虑的6个要点,以供各位参考。
1.选择血清还是血浆?
研究人员可以从血清和血浆中分离miRNA。血清是在血凝后进行的,这可能导致microRNA的具体含量存在一定的差异。这些miRNA含量的差异是由于它们在激活过程中血小板释放出miRNA,但许多研究并没有发现血清和血浆miRNA的组成有显著差异。然而,更高浓度的miRNAs在血清中不断地被检测到。
- 空腹条件
应该从早餐前还是早餐后的病人抽取血液?食物摄取可能会影响血液中的miRNA水平。miRNAs是由存在于其他粒子中的高密度脂蛋白(HDLs)代入循环中的,病人可以通过进食增加血液中脂蛋白的含量,但是,这可能会影响miRNA恢复的效率。可以肯定的是,在病人进食前,做任何抽血都是可以的。
- 控制溶血
红细胞破裂(溶血)会将miRNA泄露到血液循环中,并可能改变miRNA的水平或miRNome的组成。例如,破裂的红血球可以释放miRNA,这尤其成问题,因为它常被用作内源对照。除了改变miRNA水平,溶血还会导致血红蛋白和乳铁蛋白的释放,两者都对PCR反应产生负影响。
减少溶血,首先也是最好的方法,就是与一个经验丰富的技师一起工作。其次,仔细选择合适的样品储存和运输条件。例如,抽血时不要将样品冻结,在处理前将其保存在冰箱中。此外,避免用力摇晃管子(这也会导致溶血)。
即使有以上的预防措施,也很难避免一些红细胞的裂解,所以,你应该始终进行溶血测试,排除任何未通过此测试的样本。一个非常简单的溶血试验是Harboe直接分光光度法,涉及在415,380和450纳米波长上的3点吸光度测定。一个更复杂但更敏感的测试是miRNAs作为溶血指标的测量,如miRNA-451a和miRNA-23a-3p比率。
- 检查血细胞计数
外周血细胞的计数也使得血液中miRNA的分析变得复杂。在静脉穿刺过程中被激活的血小板数量增加,会扰乱miRnome。而且,即使你已经采取了预防措施来避免溶血,红血球也能在较长的存储期释放出一些miRNAs。如果你不能排除具有较高血细胞计数的样本,你就无能为力了。但是,要确保有这些数据,以便您可以解释任何奇怪的结果,以防它们出现。
- 使用适当的管子
有许多不同的管子可以用来收集血液,它们在保护介质和抗凝剂的含量上存在差异。这取决于两件事:血液处理时间表和使用血清还是血浆。
如果你不能立即处理样品,你必须使用含有RNA保护介质的管子,保护miRNA不被降解。这种管子可以使全血样本在冰箱里储存好几天。如果你能在几个小时内处理样品(不要超过6个小时),那么你可以使用常规的管子。
然后,你还需要决定是否要使用抗凝剂。当然,这取决于你是收集血清还是血浆。并非所有抗凝剂都是合适的。例如,肝素抑制逆转录酶和聚合酶的活性。柠檬酸可以稀释血浆,由于张力减退导致溶血,它也会干PCR的下游应用。抗凝剂的最佳选择是EDTA,因为它不太可能影响下游PCR应用或引起溶血。
- 储存条件
可以分装并将样本储存在-80°C。据大多数研究,miRNA的冻融并不影响miRNA的稳定性和恢复。