使用荧光探针的质膜染色技术
真核细胞质膜（PM）是脂质双层，组织成一个连续的屏障，将细胞环境与细胞外空间分隔开, 由质膜提供的物理屏障还用作蛋白质的生物支架，这些蛋白质介导信号转导或引发细胞响应（例如Ras 1），以响应细胞表面发生的细胞外事件。除了这些功能，PM还通过释放和接收被称为细胞外囊泡（EVs）2的封装生物分子，充当细胞间枢纽。质膜的诸多重要作用，使得通过荧光标记质膜来研究质膜功能变得越来越普遍。
今天给大家总结一下常用荧光膜探针的优缺点，并概述了最新膜探针突破，发光膜探针通过结合在质膜附近或质膜内来描绘细胞的外围。平常我们用的最多的有五类膜探针：小麦胚芽凝集素（WGA）偶联物，脂质偶联物，亲脂性染料，共价结合探针和生物物理报告探针，下面我们来对这五种常见探针做一个简要介绍：
1. 小麦胚芽凝集素（WGA）
WGA是一种凝集素，可优先结合细胞表面聚糖N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸。这些碳水化合物通常附着在蛋白质上，它们的定位可间接显示细胞膜。现在，目前WGA标记物利用Alexa Fluor缀合技术，可以对细胞表面多糖标记物进行定位，从而使科学家能够间接检测质膜。荧光团偶联的WGA探针也有显著缺点：表面多糖可以随细胞膜的组成而变化，从而在特定的细胞群体之间导致细胞间染色差异。此外，偶联的WGA由于其较大尺寸限制了其扩散，因此无法有效地染色3D培养细胞和组织。
2. PKH
PKH染料具有碳链，该碳链将荧光团插入并锚定在质膜的脂质区域，PKH染料可标记活细胞中的质膜，据报道其半衰期为5-100天，染色的必需配有专们等渗试剂。花青Paul Karl Horan（PKH）染料的化学作用使质膜的特定标记成为可能，而无需膜表达因子。当前，由PKH2，PKH26和PKH67组成的可用PKH染料具有从504 nm到567 nm的有限发射光谱，插入染料后，需要通过添加血清或BSA蛋白来完成染料淬灭步骤，无法淬灭未结合的染料会导致染料聚集并进入共培养或导致细胞结块。相关最新研究数据表明，用PKH26标记会引起外泌体肿胀，这可能会改变外泌体的正常分布和细胞摄取。通常，由于不良的水溶性，PKH标记效率低，需要相对较高的浓度来实现有效的膜染色。
3. 长链花青染料
长链亲脂性花青染料DiI，DiD，DiA，DiR和DiO是众所周知的质膜染料，涵盖了广泛的激发/发射光谱。DiO； DiOC 18（3））在501 nm处出现荧光峰，DiI在565 nm处峰，4- Di -10- ASP在590nm处，DiD在665nm处， DiR '; DiIC 18（7））在780nm处达到峰值。尽管这些碳花青染料广泛覆盖可见光谱范围，但它们实际上不溶于水。因此，它们在水溶液中强烈聚集，产生难以控制的细胞膜染色。例如，DiO无法对DiA成功染色的组织染色，而DiI可以有效地标记膜，但是远红外DiD会产生点状染色。同时在需要Triton-X 100来增加细胞通透性的共标记应用中，花青染料也不兼容。
4. MemGlow™探针
用MemGlow™探针标记的活HeLa细胞. 图片由Mayeul Collot等提供. 2019.
MemGlow™系列探针（图1）提供了一种新的磷脂膜染色解决方案，它由5种基于荧光花青的质膜探针组成，具有宽光谱范围，包括近红外（Ex: 499-689 nm，Em: 506-713nm）3。
MemGlow™探针具有其原始花青或BODIPY母体染料的许多优秀的特性，同时在某些应用中显示出比同类产品更高的标记效率。MemGlow™560和640探针的优点是基于花菁对称的化学结构，通过两个两性离子锚的化学连接进一步增强了这些结构。类似地，MemGlow™488是一种两亲性调节的BODIPY探针，通过添加两性离子锚来增强，以提高对细胞膜的特异性，使其超过了亲本BODIPY染料。两性离子锚促进了探针聚集体在质膜中的解离和嵌入，同时增强了它们的保留能力（图2）。
图2. MemGlow™探针的开启机制. MemGlow™探针是自淬灭的，直到插入质膜才能使纳米粒子激发荧光。
MemGlow™应用程序很简单,当将MemGlow™探针引入水性介质中时，两亲性探针会形成自发淬灭性的聚集体，直到与质膜的接触引发其解离并分散到脂质双层中。整合后，荧光探针即可进行生物成像。从MemGlow™488到MemGlow™700，MemGlow™探针产生的信噪比分别为20和3.4，分别之间的背景和显示出的信号与背景的比值（S / B）强烈的荧光大许多倍。MemGlow™探针是一项技术突破，优于许多现代染色剂，MemGlow™标记非常高效，甚至纳摩尔浓度也可以显示细胞间丝状伪足和纳米管（图3A和3B）。
图3A. 用MemGlow 488™染色并通过激光扫描共聚焦显微镜成像的细胞的3D重建. 用50 nM MemGlow™488染色的KB活细胞5分钟，无需清洗即可成像. 细胞间丝状伪足和纳米管在细胞之间可见（白色箭头）. 图像伪彩色为橙色. 图片由Mayeul Collot等提供. 2019.
图3B. 用20 nM MemGlow™488标记并通过激光扫描共聚焦显微镜成像的活KB细胞的质膜. 整个细胞之间可见细胞间丝状伪足和纳米管（白色箭头）. 图片由Mayeul Collot等提供. 2019.
是什么使MemGlow™成为膜标记领域的领导者？
| 探针类型 | 供应商 | MemGlow™的优势 |
| MemGlow™ | Cytoskeleton | 1. 两性离子锚定的花青素的探针显示出出色的荧光量子产率和光稳定性。 2. 较低的工作浓度（nM）可对小型生物结构进行高分辨率成像，具有低毒性，适合长期成像。 3. 5种荧光染料，其中2种属于远红外光谱，非常适合多色生物成像。 4. 与活细胞/固定细胞和组织化学染色兼容。 5. 亲脂性探针对质膜具有特异性，不能通过内吞作用快速内在化。 |
| DiI，DiO和类似物 （长链花青素） |
Thermo Fisher | 1. 与传统的花青染料相比，MemGlow™需要的工作浓度要低100倍（分别为nM和µM）。 2. MemGlow™在无毒的低浓度下具有一致的染色效果，而常规的碳菁染料显示不规则且效率低下的标记。 |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Fisher | 1. 当细胞汇合时，MemGlow™可以更均匀地标记膜。细胞间接触会抑制WGA Alexa Fluor接触多糖，并减少标记。 2. MemGlow™染色很有效。与WGA Alexa Fluor相比，在相同的相机曝光下，MemGlow™亮度更高，点状染色更少。 |
| PKH | Millipore Sigma | 1. MemGlow™所需的工作浓度比PKH染料低100倍（分别为nM与µM）。 2. MemGlow™具有简单的操作流程，与PKH染料不同，不需要探针淬灭。 3. 尚不清楚MemGlow™会引起生物学变化。 4. MemGlow™可产生可靠的细胞外囊泡染色，而据报道PKH会改变外泌体大小。 5. MemGlow™产生一致的染色，而PKH染色产生75％的可行标记细胞。 |
产品推荐：
| 名称 | 货号 |
| MemGlow™ 488: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family) | MG01 |
| MemGlow™ 560: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family) | MG02 |
| MemGlow™ 640: Fluorogenic Membrane Probe (a member of the MEMBRIGHT™ family) | MG04 |
 雷雷 |
闪闪 |
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