当用双荧光素酶报告基因测试系统来测量等重量的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶时，可观察到它们释放的光几乎相等。萤火虫荧光素酶的分子虽为61kD ,而海肾荧光素酶的 分子量为36kD ,当测试等重量的两个酶时，所测的海肾荧光素酶分子实际多69%。如以 每摩尔为基础，据实验确定，用双荧光素酶报告基因试剂测试的萤火虫荧光素酶的荧光强度 比海肾荧光素酶强大约53%。
共转染质粒所含启动子间的反式效应有可能会影响到报告基因的表达。当对照或实验报告基因载体含有很强的启动子/增强子时，需要特别加以注意。载体pRL上的TK , SV40 , CMV调节因子据报道可在大多数哺乳类细胞中表达，但它们在不同细胞中的表达 水平不同。载体pRL-TK中HSV胞喘咙激酶启动子相对较弱，使海肾荧光素酶的组成性表 达成低到中度水平。早SV40极早CMV的增强子/启动子转录水平高，当实验载体所具 有的调节因子较强时，这类启动子不太适用于双报告基因实验。
为使实验报告基因及对照报告基因的基因表达相对独立，每次实验时转染混和液中载体DNA的量及共转染报告基因载体的比例需作优化。可采用实验载体与共转染报告基因载体 的组成比在10 : 1到50 : 1或更大的范用，这有利于抑制启动子间的交互作用。有时为有利于实验，共转染混和液中的实验载体应选择为少量部分。
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