材料与仪器
琼脂糖凝胶 菌落裂解缓冲液 蒸馏水 甲醛 甲酰胺预杂交 杂交液 HotPrime cDNA Labeling Kit 矿物油 MOPS 缓冲液 MOPS 乙酸钠 EDTA PCR 缓冲液 SSC NaCl SDS NaCl NaH2PO4 [a-32P]dATP Lgh Rgh 引物 鲑鱼精 DNA Taq DNA 聚合酶离心机 滤纸片 增光屏 离心管 硝酸纤维素膜或尼龙膜 移液器 闪烁计数器 Sephadex G50 柱子 单一感光科学成像胶卷 热循环仪 薄壁 PCR 管 塑料保鲜膜
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭菌落裂解缓冲液（PCR-TRAP Cloning System,GenHunter P404 或 L102)Denhardt 溶液（500 ml)Ficoll 5 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 5 gBSA(PentaxFractionV) 5 g蒸馏水 加至 500 ml蒸馏水12.3mol/L(37%) 甲醛，pH〉4.0甲酰胺预杂交/杂交液（GenHimterMLl)，如果自己配制，使用下面的方案（500 ml)20XSSPE 125 ml50XDenhardt 溶液 50 ml20%SDS 2.5 ml甲酰胺 250 ml蒸馈水 加至 500 ml混匀后分装成较小体积，-20°C 保存备用。HotPrime cDNA Labeling Kit(GenHunterH50)，包括 KlenowDNA 聚合酶（1U/ul)、10X 标记缓冲液、dNTP(—dATP) 或 dNTP(-dCTP)(500umol/L)、中止缓冲液以及蒸馏水矿物油（可选）10XMOPS 缓冲液0.2mol/LMOPS0.05mol/L 乙酸钠0.01mol/LEDTA10XPCR 缓冲液（RNAspectra Differential Display System，F501-F510&R501-R510,PCR-TRAP Cloning System，GenHunter，P404 或 S201)20XSSC3mol/LNaCl0.3mol/L 柠檬酸三钠•2 H20用 1mol/LHC1 调 pH 至 7.01XSSC,1g/L SDS0.25XSSC,1g/L SDS20XSSPE3mol/LNaCl0.1mol/LNaH2PO4(二代盐）0.02mol/LEDTA中止缓冲液（0.lmol/LEDTA,pH8.0)2. 核酸和寡核苷酸[a-32P]dATP(3000Ci/umol/L)(1Ci=3.7X1010Bq)dNTP(250umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHunter P404 或 S501)Lgh/Rgh 引物（2umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHimter P404 或 L201&L202)鲑鱼精 DNA(GenHunter ML2)3. 酶和酶缓冲液Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207)4. 专用设备离心机3 mm 滤纸片增光屏1.5 ml 离心管硝酸纤维素膜或尼龙膜移液器闪烁计数器Sephadex G50 柱子（Roche Applied Science 1814419，Indianapolis，IN)单一感光科学成像胶卷 [推荐 Kodak Biomax MS，No.8715187(Kodak-Eastman，Rochester，NY)]热循环仪0.2 ml 薄壁 PCR 管可透过紫外线的塑料保鲜膜 [推荐 Glad Cling Wrap(The Glad Products Company，Oakland,CA)]5. 附加试剂QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit(Qiagen20021)二、方法1.cDNA 探针的产生（1）在每个克隆平板的底部，为每个待分析的四环素抗性菌落编号（推荐每个平板至少选 5 个）。（2）在 1.5 ml 离心管中，各分装 5ul 菌落裂解缓冲液。（3）用干净的移液头挑取每个菌落，尽量不要取太多（通常肉眼可见的很小量就足够了）。将细胞转到相应标记的 1.5 ml 离心管中。（4）将离心管在沸水浴中温育 10min。（5）以最大速度在室温下离心 2 min，以沉淀细胞残余物。将上清液转到干净的 1.5 ml 离心管中，弃去残余沉淀。（6）裂解产物立即用于 PCR 分析，或保存在-20°C 备用。（7）将下列组分加到 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，用来做菌落 PCR(强烈推荐先配制一个核心混合液，含有除了菌落裂解液以外的所有组分，这样可以将吸取样品的误差降至最小）。蒸馏水 10.2ul10XPCR 缓冲液 2.0uldNTP 混合液（250umol/L) 1.6ulLgh 引物 2.0ulRgh 引物 2.0ul菌落裂解液 2.0ulTaq DNA 聚合酶 0.2ul混合均匀，如果需要加入 30ul 矿物油。（8）按照下列程序设置热循环仪：94°C 30s → 52°C 40s → 72°C lmin → 30 个循环 → 72°C 5 min(延伸) → 4°C 保温。（9）在含有溴化乙锭染料的 1.5% 琼脂糖凝胶上，将 20ulPCR 产物全部跑电泳。这不仅可以产生 Northern 印迹分析所用的 cDNA 探针，而且还显示出使用 PCR-TRAP CloningSystem 产生的 cDNA 克隆（见方案 6) 中哪一个含有正确的插入片段。（10）用 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit 从琼脂糖凝胶中纯化各条带。纯化片段做模板，用 HotPrime DNA Labeling Kit 产生探针。（11）如果使用不同的载体进行克隆，要根据厂商的建议产生 Northern 印迹杂交所需的 cDNA 探针。2.cDNA 探针的标记（12）如果使用推荐的 HotPrime DNA Labeling Kit，将所有组分完全解冻后，立即置于冰上。（13）在带有固定帽（这样在煮沸过程中管帽不会松动）的 1.5 ml 离心管中，配制下面的反应体系。蒸馏水 11ul10X 标记缓冲液 3ul用于标记的 DNA 模板（10~50ng) 7ul（14）将反应混合液在沸水浴中温育10 min。（15）将反应管在冰上迅速冷却。短暂离心，收集冷凝水。（16）按照下面的顺序加入反应试剂。dNTP(-dATP)(500umol/L~undefined 3ul[a-32P]dATP(3000Ci/mmol/L~undefined 5ulKlenow DNA 聚合酶 1ul~undefined如果用 [a-32P]dCTP 代替 [a-32P]dATP, 则用 dNTP(—dCTP) 代替 dNTP(-dATP)。（17）将混合液在室温放置 20 min, 然后在 37°C 温育 10min。（18）加入中止缓冲液，混匀。（19）用 Sephadex G50 柱纯化标记的探针。用带有固定帽的 1.5 ml 离心管收集纯化的探针。在闪烁计数器中，对 1ul 标记的探针进行计数。对大多数标记的 DNA 探针，一共可以获得 1000 万或更多的 cpm。3. 探针杂交（20）制备变性琼脂糖（RNA) 凝胶（包括加样与电泳条件，以及 RNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜）的方案，在 Ausubel 等（1995) 及 Sambrook 和 Russell(2001) 中都有介绍。（21）如果预杂交缓冲液保存在-20°C，则在 37°C 解冻 20 min。（22）在沸水浴中温育 10 min, 变性鲑鱼精 DNA。（23）在预杂交溶液中加入鲑鱼精 DNA(终浓度为 100~200ug/ml)，混匀。（24）用 5 ml 或足够董的预杂交溶液将膜覆盖，在 42°C 下预杂交至少 4 h。（25）用一个带有固定帽的 1.5 ml 离心管（否则管帽会松动），在水浴中煮沸10min, 以变性纯化的探针。（26）在冰上冷却 2 min。（27）离心甩下冷凝水，将探针直接加到预杂交溶液中。（28）杂交过夜。（29）小心地倒出放射性的杂交液，在专门盛放放射性废液的容器中处理。（30）在室温下，用含有1g/LSDS 的 1XSSC 洗涤 2 次。都要在专用的容器中处理洗涤溶液。（31）用预热的含有1g/L SDS 的 0.25XSSC，在 50~55°C 下漂洗 15~20 min。4. 印迹曝光（32）用 3 mm 的滤纸将膜吸干，并用可透过 UV 的塑料薄膜包起来。（33）将印迹在带有强化屏的单色光胶片下曝光，在-70°C 具有最佳的检测信号。
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