流式细胞术样本处理标准化操作指南

一、样本处理基本原则

1. 时效性：所有样本应在采集后12小时内完成处理，特殊保存条件下可延长至48小时
2. 抗凝选择：根据检测目的选择抗凝剂（EDTA/肝素/ACD）
3. 防污染：操作全程需在生物安全柜内进行，使用无菌器械及耗材
4. 细胞活性：避免极端温度变化，禁止使用固定剂或表面活性剂处理

二、不同类型样本处理规范

1. 外周血及骨髓样本 （1）抗凝剂选择标准

• EDTA：适用于免疫表型分析（CD45+/CD3+等）
• 肝素：推荐用于功能检测（趋化性/吞噬活性）
• ACD：适用于长时间运输样本（72h稳定性）

（2）处理流程 ① 标本接收后立即进行细胞计数（Coulter计数法） ② 红细胞裂解：使用ACK缓冲液（8min室温孵育） ③ 淋巴细胞富集：仅限科研用途（Ficoll密度梯度离心）

2. 体液样本（胸腹水/脑脊液） （1）预处理方案 步骤 | 操作要点 | 参数 --- | --- | --- 1 | 离心浓缩 | 1500×g 5min（4℃） 2 | 细胞洗涤 | PBS+0.1% BSA（pH7.2-7.4） 3 | 过滤处理 | 300目尼龙网（单细胞悬液制备） 4 | 细胞活化 | Trypan蓝染色（活率>85%）

（2）特殊注意事项 • 脑脊液需梯度离心（先150×g 10min，后1500×g 5min） • 胸腹水需检测LDH活性（>1000U/L提示恶性积液）

3. 固有免疫组织样本 （1）机械分散法操作规范 步骤 | 操作要点 | 质控标准 --- | --- | --- 1 | 组织清洗 | 生理盐水灌洗（去除红细胞） 2 | 组织剪切 | 眼科剪（<1mm³组织块） 3 | 匀浆处理 | 电动匀浆器（功率25%，3次/10s） 4 | 过滤处理 | 70μm细胞筛（细胞回收率>90%）

（2）替代方案选择 • 肝脏组织：推荐Ⅱ型胶原酶消化（37℃ 30min） • 淋巴结：需分层剪切（皮质/髓质分别处理）

三、质量控制体系

1. 细胞活性检测：台盼蓝排除法（每批次必检）
2. 抗原完整性验证：设置未染色对照组
3. 流式检测参数设置：

• 电压校准：使用Fluorescent微球（Spherotech）
• 采集阈值：设定前向散射（FSC）为10^3
• 采集量：至少检测10,000个目标细胞

四、保存条件对照表

本操作规范适用于临床流式检测及基础免疫学研究，具体实验需根据检测目的调整处理方案。建议建立实验室内部质控体系，定期进行方法学验证。