文献标题：Abnormal Redox Balance at Membrane Contact Sites Causes Axonopathy in Gdap1-related Charcot-marie-tooth Disease
DOI:https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-5682984/v1
研究背景
Charcot-Marie-Tooth病（CMT）是一种常见的遗传性神经病变，其特征是轴突退化。GDAP1基因的致病变异会导致CMT，该基因编码一种非典型谷胱甘肽S转移酶，定位于线粒体外膜（OMM），调节线粒体的动态、运输和膜接触位点（MCSs）。GDAP1被认为可能作为细胞氧化还原（redox）传感器，但其在氧化还原平衡中的具体作用尚不清楚，尤其是在线粒体MCSs中的氧化还原调节机制。
研究内容
本研究旨在探讨GDAP1在过氧化物酶体功能和线粒体MCSs维持中的作用，并研究其与氧化还原平衡的关系。研究使用了高分辨率显微镜、活细胞成像、转录组学和脂质组学分析等方法，研究对象包括Gdap1基因敲除（Gdap1-/-）小鼠和患者来源的成纤维细胞。
研究方法
1.细胞培养和转染：使用人类成纤维细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系，通过脂质体介导的转染方法将GDAP1基因导入细胞。
2.动物模型和胚胎运动神经元培养：使用Gdap1基因敲除小鼠模型，从胚胎脊髓中分离培养运动神经元。
3.免疫荧光和共免疫沉淀实验：通过免疫荧光标记线粒体、过氧化物酶体等细胞器，并使用共免疫沉淀实验验证蛋白质之间的相互作用。
4.活细胞成像和pH测量：使用pH敏感的荧光探针pHluorin2测量线粒体-溶酶体接触位点的pH值。
5.转录组学和脂质组学分析：对患者成纤维细胞进行RNA测序，分析基因表达差异；对小鼠脊髓和坐骨神经样本进行脂质组学分析，检测磷脂水平的变化。
6.药物干预实验：使用PPARγ激动剂Leriglitazone处理患者成纤维细胞，观察对过氧化物酶体数量和形态的影响。
研究结果
GDAP1是线粒体-过氧化物酶体MCSs的锚定蛋白：研究发现GDAP1缺失会破坏线粒体-过氧化物酶体的MCSs，导致过氧化物酶体数量减少和形态异常。通过药理激活PPARγ或补充谷胱甘肽可以逆转这些异常。
GDAP1缺失导致氧化还原失衡：在患者成纤维细胞中，线粒体-溶酶体接触位点的pH值显著降低，表明GDAP1可能在这些微域的氧化还原状态下发挥调节作用。
PPARγ激活可恢复过氧化物酶体缺陷：使用PPARγ激动剂Leriglitazone处理患者成纤维细胞后，过氧化物酶体数量和形态恢复正常，表明PPARγ可能是治疗GDAP1相关CMT的潜在靶点。
Gdap1-/-小鼠坐骨神经的结构异常：在Gdap1-/-小鼠的坐骨神经中，线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的分布异常，且轴突结构出现显著缺陷，包括郎飞结的破坏和神经传导速度的降低。
转录组学和脂质组学分析：发现GDAP1缺失影响了多个与氧化还原平衡、细胞应激反应和细胞器间接触相关的基因表达，同时在坐骨神经中检测到磷脂水平的变化，提示氧化应激和脂质代谢紊乱。
综上所述，本研究揭示了GDAP1在维持细胞氧化还原平衡和神经轴突完整性中的重要作用，并提出了PPARγ作为治疗GDAP1相关CMT的潜在靶点。
在文献《Abnormal Redox Balance at Membrane Contact Sites Causes Axonopathy in Gdap1-related Charcot-Marie-Tooth Disease》中，Anti-GDAP1 Antibody和Anti-S100B Antibody的具体应用如下：
Anti-GDAP1 Antibody（ATL-HPA024334 和 ATL-HPA014266）
1.检测GDAP1蛋白的表达水平：
Western Blot：用于验证GDAP1蛋白在不同样本中的表达水平，特别是在Gdap1基因敲除（Gdap1-/-）小鼠和患者成纤维细胞中的表达情况。
2.免疫荧光（Immunofluorescence）：用于标记和定位GDAP1蛋白，观察其在细胞中的分布情况。
3.验证蛋白质相互作用：
共免疫沉淀（Co-IP）：用于验证GDAP1与其他蛋白的相互作用，例如与PEX14（过氧化物酶体膜蛋白）和MFN2（线粒体融合蛋白）的相互作用。
Anti-S100B Antibody（ATL-AMAb91038）
1.标记神经胶质细胞（Schwann细胞）：
免疫荧光（Immunofluorescence）：用于标记坐骨神经切片中的Schwann细胞，观察其分布和形态变化。
2.研究神经胶质细胞与轴突的相互作用：
S100β标记的Schwann细胞在坐骨神经中与轴突紧密相关，其分布和形态的变化可以反映轴突的健康状态。文献中通过观察S100β标记的Schwann细胞的分布和形态变化，发现GDAP1缺失导致Schwann细胞与轴突之间的通信受损，进而影响神经纤维的结构和功能。
总结
Anti-GDAP1 Antibody：
用于检测GDAP1蛋白的表达水平（Western Blot）。
用于标记和定位GDAP1蛋白，观察其在细胞中的分布情况（免疫荧光）。
用于验证GDAP1与其他蛋白的相互作用（共免疫沉淀）。
Anti-S100B Antibody：
用于标记神经胶质细胞（Schwann细胞），观察其分布和形态变化（免疫荧光）。
用于研究神经胶质细胞与轴突的相互作用，反映轴突的健康状态。
这些抗体在文献中起到了关键作用，帮助作者揭示了GDAP1在维持细胞氧化还原平衡和神经轴突完整性中的重要作用，以及S100β标记的Schwann细胞在神经纤维健康中的作用。
