Atlas Antibodies:膜接触部位异常氧化还原平衡文献解析

文献标题:Abnormal Redox Balance at Membrane Contact Sites Causes Axonopathy in Gdap1-related Charcot-marie-tooth Disease

DOI:https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-5682984/v1

 

研究背景

Charcot-Marie-Tooth病(CMT)是一种常见的遗传性神经病变,其特征是轴突退化。GDAP1基因的致病变异会导致CMT,该基因编码一种非典型谷胱甘肽S转移酶,定位于线粒体外膜(OMM),调节线粒体的动态、运输和膜接触位点(MCSs)。GDAP1被认为可能作为细胞氧化还原(redox)传感器,但其在氧化还原平衡中的具体作用尚不清楚,尤其是在线粒体MCSs中的氧化还原调节机制。


研究内容

本研究旨在探讨GDAP1在过氧化物酶体功能和线粒体MCSs维持中的作用,并研究其与氧化还原平衡的关系。研究使用了高分辨率显微镜、活细胞成像、转录组学和脂质组学分析等方法,研究对象包括Gdap1基因敲除(Gdap1-/-)小鼠和患者来源的成纤维细胞。


研究方法

1.细胞培养和转染:使用人类成纤维细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系,通过脂质体介导的转染方法将GDAP1基因导入细胞。

2.动物模型和胚胎运动神经元培养:使用Gdap1基因敲除小鼠模型,从胚胎脊髓中分离培养运动神经元。

3.免疫荧光和共免疫沉淀实验:通过免疫荧光标记线粒体、过氧化物酶体等细胞器,并使用共免疫沉淀实验验证蛋白质之间的相互作用。

4.活细胞成像和pH测量:使用pH敏感的荧光探针pHluorin2测量线粒体-溶酶体接触位点的pH值。

5.转录组学和脂质组学分析:对患者成纤维细胞进行RNA测序,分析基因表达差异;对小鼠脊髓和坐骨神经样本进行脂质组学分析,检测磷脂水平的变化。

6.药物干预实验:使用PPARγ激动剂Leriglitazone处理患者成纤维细胞,观察对过氧化物酶体数量和形态的影响。


研究结果

GDAP1是线粒体-过氧化物酶体MCSs的锚定蛋白:研究发现GDAP1缺失会破坏线粒体-过氧化物酶体的MCSs,导致过氧化物酶体数量减少和形态异常。通过药理激活PPARγ或补充谷胱甘肽可以逆转这些异常。

GDAP1缺失导致氧化还原失衡:在患者成纤维细胞中,线粒体-溶酶体接触位点的pH值显著降低,表明GDAP1可能在这些微域的氧化还原状态下发挥调节作用。

PPARγ激活可恢复过氧化物酶体缺陷:使用PPARγ激动剂Leriglitazone处理患者成纤维细胞后,过氧化物酶体数量和形态恢复正常,表明PPARγ可能是治疗GDAP1相关CMT的潜在靶点。

Gdap1-/-小鼠坐骨神经的结构异常:在Gdap1-/-小鼠的坐骨神经中,线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的分布异常,且轴突结构出现显著缺陷,包括郎飞结的破坏和神经传导速度的降低。

转录组学和脂质组学分析:发现GDAP1缺失影响了多个与氧化还原平衡、细胞应激反应和细胞器间接触相关的基因表达,同时在坐骨神经中检测到磷脂水平的变化,提示氧化应激和脂质代谢紊乱。


综上所述,本研究揭示了GDAP1在维持细胞氧化还原平衡和神经轴突完整性中的重要作用,并提出了PPARγ作为治疗GDAP1相关CMT的潜在靶点。

在文献《Abnormal Redox Balance at Membrane Contact Sites Causes Axonopathy in Gdap1-related Charcot-Marie-Tooth Disease》中,Anti-GDAP1 Antibody和Anti-S100B Antibody的具体应用如下:


Anti-GDAP1 AntibodyATL-HPA024334 和 ATL-HPA014266)

1.检测GDAP1蛋白的表达水平:

Western Blot:用于验证GDAP1蛋白在不同样本中的表达水平,特别是在Gdap1基因敲除(Gdap1-/-)小鼠和患者成纤维细胞中的表达情况。

2.免疫荧光(Immunofluorescence):用于标记和定位GDAP1蛋白,观察其在细胞中的分布情况。

3.验证蛋白质相互作用:

共免疫沉淀(Co-IP):用于验证GDAP1与其他蛋白的相互作用,例如与PEX14(过氧化物酶体膜蛋白)和MFN2(线粒体融合蛋白)的相互作用。


Anti-S100B AntibodyATL-AMAb91038)

1.标记神经胶质细胞(Schwann细胞):

免疫荧光(Immunofluorescence):用于标记坐骨神经切片中的Schwann细胞,观察其分布和形态变化。

2.研究神经胶质细胞与轴突的相互作用:

S100β标记的Schwann细胞在坐骨神经中与轴突紧密相关,其分布和形态的变化可以反映轴突的健康状态。文献中通过观察S100β标记的Schwann细胞的分布和形态变化,发现GDAP1缺失导致Schwann细胞与轴突之间的通信受损,进而影响神经纤维的结构和功能。


总结

Anti-GDAP1 Antibody:

用于检测GDAP1蛋白的表达水平(Western Blot)。

用于标记和定位GDAP1蛋白,观察其在细胞中的分布情况(免疫荧光)。

用于验证GDAP1与其他蛋白的相互作用(共免疫沉淀)。


Anti-S100B Antibody:

用于标记神经胶质细胞(Schwann细胞),观察其分布和形态变化(免疫荧光)。

用于研究神经胶质细胞与轴突的相互作用,反映轴突的健康状态。


这些抗体在文献中起到了关键作用,帮助作者揭示了GDAP1在维持细胞氧化还原平衡和神经轴突完整性中的重要作用,以及S100β标记的Schwann细胞在神经纤维健康中的作用。

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