SLP技术是基于标记分子和融合标签目的蛋白(POI)殊的共价键。首先,克隆并将目的蛋白表达为融合蛋白,然后通过一个带标记的修饰底物来标记SLP。标记可以是想要研究的任何分子,比如荧光染料、捕获标签,或者任何你需要的探针。这种蛋白质标记反应通常是快速和定量的,在体内和体外应用中都是理想模型。
基本步骤具体如下:
- 基因融合
将目的蛋白与标签融合表达,一般情况下,可以将目的蛋白编码基因克隆到载体中标签的任何一端,不影响蛋白质的功能。使用最多的商业SLP系统有Promega HaloTag®,SNAP-tag®和CLIP-tagTM。
- 共价标记
通常,SLPs是一种经过工程改造的酶,它能与底物发生共价反应。底物被修饰为含有标记分子的一系列合成衍生物。当把融合标签目的蛋白和底物一起孵育,会形成一个稳定的共价键,使你的目的蛋白带上所需的标记分子。
几种常用标签的介绍
- HaloTag
HaloTag蛋白是一种细菌脱卤酶的突变体,这种酶通过亲核的天冬氨酸残基来去除脂肪族烃分子中的卤素。野生型的酶能够再生其催化部位以促进进一步的脱卤作用,基因工程HaloTag蛋白则允许它与底物形成不可逆转的共价键。这种类型的连接可以使蛋白质与你所选择的任何标记的氯烷烃配体形成稳定的结合,对下游的应用很有用。真核细胞和大多数原核生物(包括大肠杆菌) 缺乏原生蛋白质,可以使用多种表达宿主来实现目的蛋白的特定标记。
- SNAP-Tag
SNAP-tag技术是基于人O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase(hATG) ,这一DNA修复酶将突变的六烷基鸟嘌呤DNA的烷基转移到它的半胱氨酸残基中,以释放鸟嘌呤。利用这一不可逆过程,基于hATG的SNAP-tag蛋白能特异性识别并与苄基鸟嘌呤(BG)反应,BG是一种带标记的鸟嘌呤。
在共价标记过程中,SNAP-tag的催化半胱氨酸与BG的标记基团组形成了稳定的结合,这种反应是高度特异性的。可以使用任何一个表达宿主,以及一系列标记底物,可以在细胞表面和细胞内的几乎任何地方贴上标签。
- CLIP-Tag
如果你想做双重标记,CLIP-tag是一个适合的方法。CLIP-tag是用来补充SNAP-tag的,可以在一个实验中应用这两种类型的融合。CLIP-tag蛋白也是hATG的衍生物,与 SNAP-tag蛋白具有相同的特性。这个SLP特异性识别苄基胞嘧啶(BC)并与之反应,BC是一种与带标记的胞嘧啶。通过使用SNAP-和CLIP标签技术,将同时为两种融合蛋白标记两种不同的探针。
SLPs的适用范围和应用
这项技术并不局限于发光底物,其他合适的标签包括生物素,磁珠和金颗粒等也能实现亲和结合或蛋白质固定。最常用的是,荧光分子被连接到底物上,以完成细胞成像应用,如蛋白质定位和功能分析。SLPs相比荧光蛋白具有如下几个优势:
1.更多的荧光染料的选择;
2.更高的荧光强度和光稳定性;
3.添加标记时启动荧光(时序控制);
4.一个单独的结构可以标记不同的荧光团(多色成像);
6.在活细胞和固定细胞中,荧光都很强烈。