通过研究免疫细胞的激活，科学家可以了解人体对特定感染、自身免疫疾病或癌症的反应方式，这在开发更有效的疫苗和治疗方法方面发挥着直接作用。当捕捉免疫细胞激活的信息时，流式细胞术由于其通用性、易用性和数据生成的便捷性，无疑是一种金标技术。
流式细胞仪分析单个事件并以每秒数千个事件的速度记录多个参数。通过对这些数据集的查询，可以在很短的时间内对数千个细胞进行量化，从而得到统计上可靠的数据，甚至有仪器可以用来观察多达27种不同的荧光染料。
准备工作
在开始免疫细胞激活实验之前，有几个参数需要考虑。
首先，需要为实验确定目的细胞，将它们从混合细胞种群中分离出来，还是使用细胞表面标记将它们与其他细胞类型区分开来。
此外，需要确定刺激方法，例如，靶细胞、化学物质、抗原多肽，这将影响如何检测发生的激活。例如，如果用靶细胞刺激目的细胞(寻找细胞毒性能力)，则脱粒试验更为合适，而化学和抗原刺激则更适合增殖研究。
最后，要注意激活免疫细胞会导致表型、基因调控以及功能的改变。
本文介绍三种最常用的通过流式细胞术检测免疫细胞活化的方法。
- 表面抗体染色
在遇到病原体之前，免疫细胞处于静止状态。外来病原体的刺激或暴露于促炎环境中，可导致细胞内信号级联反应，并最终导致细胞表面蛋白的改变。
例如，当有合适的抗原时，未成熟的T细胞将被刺激产生成熟标记(如CD69, CD25)，这些标记有助于这个新分化的效应细胞的增殖，表面蛋白表达的变化可用流式细胞术测定。关于细胞功能(如增殖、促/抗炎症细胞因子生成、细胞毒蛋白生成)的更多信息，可以结合表面抗体染色和细胞内细胞因子染色。
- 胞内细胞因子染色
任何免疫反应都有4个主要特征：发热；疼痛；肿胀；发红。这些生理特征是免疫细胞大量涌入感染部位的直接结果，因为前哨细胞遇到异物释放了细胞因子。细胞因子是一种小蛋白，在细胞间的通讯、免疫细胞的运输和环境的设定中起重要作用(如促炎vs .抗炎)。
细胞因子检测使研究人员能够研究特定抗原刺激的反应，流式细胞术的使用提供了一种能力，以确定哪些特定细胞类型正在产生哪些细胞因子。为了达到这一目的，首先对受刺激的细胞使用一种阻断蛋白质运输的物质，如布雷菲德菌素A或莫能菌素，然后对其进行固定和渗透，使细胞因子特异性抗体达到其靶点。使用直接偶联荧光基团的抗体来标记细胞内细胞因子，它们通常比细胞表面蛋白要少，这将是检测它们存在的最佳机会。
- 细胞增殖
在对病原体作出反应后，免疫细胞将被激活并增殖以增加其种群数量。这是一个重要的研究点，特别是当试图发现在特定的感染过程中，哪种免疫细胞数量增长最快，或者不同龄细胞如何在细胞激活反应中发挥作用。
Ki-67：核蛋白Ki-67在细胞周期活跃期上调，是一种常用的检测细胞增殖的标志物。与其他方法相比，这种方法非常容易使用，但通常会造成高背景，这在细胞仪的实验设置和数据分析过程中需要注意。
BrdU：研究增殖的一种方法是标记正在复制的DNA。传统的检测方法是使用放射性标记的胸苷，在复制过程中它可以被整合到DNA中，然后用液体闪烁法检测。然而，基于放射性的分析方法有很大缺陷，为了避免这种危险，BrdU是一种好的选择，BrdU也可以与复制细胞的新合成DNA结合（S期）。偶联荧光的BrdU抗体用于流式细胞术检测BrdU，但BrdU可能会引起DNA突变。
染料稀释法：染料稀释法是利用染料对细胞蛋白进行荧光标记。CFSE是一种细胞渗透性染料，它与细胞内的分子共价结合，使CFSE在细胞内保持较长时间。随着细胞的分裂，CFSE也在分裂，细胞的每一次分裂都被观察到CFSE荧光在前一阶段的一半。该方法简便易行，可与流式细胞仪上的其他细胞表面染色相结合。CFSE是非常明亮的，因此在与其他荧光染料结合时需要谨慎使用，以确保使用了正确的补偿和门设置。由于CFSE和GFP具有相同的激发/发射光谱，因此在同一实验中不能同时使用它们。还有一些染料与CFSE类似，用于研究染料稀释方法，但具有不同的激发和发射谱，因此可以与GFP或其他荧光蛋白结合使用。
流式细胞术是研究多种条件下免疫细胞活化的重要工具。因为流式细胞术允许每秒检查数千个细胞，所以可以非常迅速地收集大量数据。随着越来越多的流式细胞仪的出现和越来越多的荧光染料的出现，检测免疫细胞的活化会越来越方便。
