在过去的十年里，生物制剂在治疗药物领域的应用越来越广泛。对于抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates，ADCs），抗体的内化是一种重要的作用机制，它可以促使ADCs从靶细胞质膜上的结合位点转移到溶酶体的裂解环境中，从而释放与其连接的毒素。
内化的效率直接影响着ADCs的治疗指数，因此需要提供一种方便、高效且易于使用的工具来研究抗体的内化过程和标记。
上期我们介绍了基于生物毒素皂草素(ZAP)二级偶联物的抗体内化检测方案：抗体内化，抗体药物筛选经典方案（中文操作指南）
今天我们给大家带来一款基于荧光报告探针的抗体内化检测工具——pHast(替代pHrodo技术)，pHast偶联物是定量检测抗体的特异性、结合情况和内化水平的zui快工具之一，可在1天内获得结果，pHast是一种pH依赖性荧光报告探针，这种荧光报告探针在胞外中性pH下几乎无荧光，一旦内化进入细胞后可发出明亮的荧光。pHast于二抗形成pHast偶联物，可以很方便的检测抗体的内化水平。
pHast偶联物检测原理及应用示例：
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| pHast偶联物用于检测抗体内化的原理示意图 |
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| pHast抗体内化检测: 正常的HEK-293细胞和转染p75受体的HEK-293细胞，孵育小鼠192-IgG，然后用Fab-pHast Mouse (Cat. #PH-02)检测内化效果, 可发现HEK-293-p75荧光信号显著增强； |
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| Fab-pHast human(Cat# PH-01)对人一抗的特异性、结合性和内化水平定量检测结果 |
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| Fab-pHast Mouse(Cat. #PH-02)的荧光信号随pH变化；Fab-pHast Mouse(Cat. #PH-02)检测HEK-293-p75细胞的荧光信号 |
我们可以提供不同种属来源，完整IgG以及Fab片段的pHast缀合物：
| 适用的一抗种类 | pHast缀合物识别的抗体区域 | ||
| 完整 IgG | 完整 IgG | Fc | |
| alpaca/llama IgG(VHH domain)(羊驼) | Alpaca-pHast(PH-05) | ||
| Chicken IgY(鸡) | Chick-pHast(PH-06) | ||
| Goat IgG(山羊) | Goat-pHast(PH-07) | ||
| Guinea pig IgG(豚鼠) | gPIG-pHast(PH-08) | ||
| Human IgG(人) | Hum-pHast(PH-09) | Fab-pHast human (PH-01) |
FabFc-pHast human(PH-10) |
| Human IgM(人) | Hug-M-pHast(PH-11) | FabFc-pHast Hug-M(PH-04) | |
| Mouse IgG(小鼠) | Mab-pHast(PH-12) | Fab-pHast mouse (PH-02) |
FabFc-pHast mouse(PH-13) |
| Mouse IgM(小鼠) | Anti-M-pHast(PH-14) | ||
| Rabbit IgG(兔子) | Rab-pHast(PH-15) | Fab-pHast rabbit (PH-16) |
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| Rat IgG(大鼠) | Rat-pHast(PH-17) | Fab-pHast rat (PH-18) | FabFc-pHast rat (PH-19) |
由可识别整个IgG的完整抗体组成 |
由可识别整个IgG分子的单价(Fab)片段组成 |
由只识别Fc区域的单价(Fab)片段组成 |
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除了抗体pHast偶联物，同时我们还可以提供链霉亲和素pHast偶联物（PH-03）,链霉亲和素pHast与生物素化蛋白结合，通过pH依赖性荧光报告探针（pHast）来检测药物内化水平：
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| Streptavidin-pHast荧光信号随pH变化，Spectra Max GeminiEM (Ex: 532nm/EM: 560nm). |
引文赏析：
- Shramm PA, Ancheta L (2019) Streptavidin-pHast: A readily conjugatable, pH-sensitive dye to screen for internalization. Cancer Res 79(13 Suppl):2177. Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, Atlanta GA.
- Kinneer K, Meekin J, Tiberghien AC, Tai YT, Phipps S, Kiefer CM, Rebelatto MC, Dimasi N, Moriarty A, Papadopoulos KP, Sridhar S, Gregson SJ, Wick MJ, Masterson L, Anderson KC, Herbst R, Howard PW, Tice DA (2018) SLC46A3 as a potential predictive biomarker for antibody-drug conjugates bearing noncleavable linked maytansinoid and pyrrolobenzodiazepine warheads. Clin Cancer Res 24(24):6570-6582. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-1300
- Shramm PA, Ancheta L, Higgins D, Lappi DA (2017) A rapid, pH-sensitive screening method to detect internalization of cell surface markers for development of antibody-based pharmaceuticals to treat brain tumors. Neuroscience 2017 Abstracts 566.24 / H7. Society for Neuroscience, Washington, DC.
- Ancheta L, Shramm PA, Lappi DA (2017) Method for screening neuronal tumor cell surface markers for high specificity and rapid internalization as potential oncologic treatments. Neuroscience 2017 Abstracts 612.11 / SS46. Society for Neuroscience, Washington, DC.
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