随机光学重建显微镜（STORM）技术解读

风暴的基本概念一个相当大的变化，Palm和FPALM已采用多种激励计划及合成荧光基团和荧光蛋白的诱导暗态。

STORM成像的荧光探针

适合用于成像与暴风相关的超分辨率方法的荧光探针是那些具有非常高的亮度和对比度的水平，在光漂白前每个分子的光子产生的最大数目，或返回到一个黑暗的，非荧光的状态。对于所有的荧光基团的摩尔消光系数和荧光量子产率，低疲劳率，和交换动力学，很容易地控制。因此，在光漂白或光控暗状态而言，最好的探针是那些失活可以平衡，以确保在任何特定时间，只有一小分子中是激活的激活率。

除了高亮度水平和光控稳定性的要求，超分辨率探针必须是能够拟定精度高的亚细胞目标化，他们应该具有尽可能低的背景噪声水平。荧光蛋白，混合动力系统相结合的一种基因编码的目的肽与一个单独的合成染料膜渗透物的组件，高度特异性的合成荧光团（如MitoTrackers LysoTrackers SYTO荧光团）是能靶向蛋白组装或细胞器。

Abbkine公司的Trakine^TM细胞染色试剂盒以及Trakine^TM Pro活细胞试剂盒所用的染料完美的印证了这一功能。利用TraKine™ Pro荧光探针，成功记录STORM显微镜下成功观测到活细胞细胞核/溶酶体和线粒体相互作用过程。为研究亚细胞器结构之间的相互作用以及它们背后的分子生物学机制提供条件。得益于庄小威院士的启发，Abbkine TraKine™ Pro系列荧光染料应运而生，主要包括以下四个品类的产品。

属性选择合成探针STORM成像

影响因素STORM成像分辨率

STORM，PALM，FPALM的技术，如超分辨单分子成像的理论基础虽然先前已详细讨论了，在确定任何特别的调查使用这些方法的实际结果的因素有很多。其中的关键方面是必须考虑的是，每个单独的定位测量的准确度，已被定位在最终图像中（通常被称为分子密度）的探针的密度，和标签本身的物理尺寸。分辨率和单分子定位精度之间的关系是很容易确定。能力解决两个荧光分子作为单独的实体的位置定位的精度，这决定了（不确定性）的每个分子中，从而对之间的距离是有限的。反过来，定位的精度，主要是依赖于单个激活-去激活周期收集的荧光分子的光子数，提供了背景噪声可以忽略不计。

双色彩风暴成像

在荧光显微术的主要优点是容量乘以与一个以上的荧光基团标记的图像样本来生成图像的二，三，四种颜色，帮助解开的相对的组织和不同的生物结构或分子之间发生的相互作用。在两个或两个以上的荧光标记探针驻留在同一决议体积的情况下，他们可以被视为经典的共定位分析算法，以确定发射光谱之间的重叠程度。在两个或两个以上的颜色是必不可少的，用于探测生物分子之间的相互作用，并提供了宝贵的洞察许多生物过程的性质，如果它可以成功地应用到超分辨率成像。

三维风暴成像

绝大多数生物结构的三维实体，从而表现出横向和轴向尺寸范围在几十微米或以上的功能，很容易解决的许多流行的成像方式在荧光显微镜。这种能力扩展到单分子的超分辨成像，精确地确定一个机制来激活荧光横向和轴向位置的境界是必要的。不幸的是，荧光团的轴向位置上的准确的信息是很难取得衍射受限的三维成像，因为焦平面附近的区域中的点扩散函数是对称的。呈现确切位置的两个分子位于焦平面上方或下方在纳米之间难以区分。此外，该点扩散函数也包含在焦平面附近的一个较大的区域（高达几百纳米）使其难以跨越的荧光有关的轴向位置的信息很少本地化分子居住的任何地方附近的宽视场显微镜的焦平面。

单分子风暴型三维成像的另一种方法利用多焦点的平面成像，以实现轴向分辨率的衍射极限以下。通过同时成像在试样中的两个焦平面，激活的荧光团的图像可以被分析，以适应一个三维点扩散函数，以确定它们的空间坐标。

活细胞STORM成像

进行时间分辨的图像序列捕获的活细胞和组织的结构是荧光显微镜的标志成果之一，并可以实施与几乎所有的对比度或光学切片模式，包括宽视场，激光扫描共聚焦，旋转盘，总的内部反射和多光子显微镜。

因为dSTORM利用常用的有机荧光基团（如Cy5标记的Alexa Fluor 488，ATTO 655）所表现出的的固有光控性能，是不要求精确共轭的第二荧光激活。因此，dSTORM可以产生衍射极限的下方，使用与选定的合成荧光标记活细胞显着高分辨率的图像。该技术也被检查翻译用Cy5的Alexa Fluor 647标记的微丝在体外吸附在玻璃表面，很容易转换成应用程序与其他常见的生物大分子沿肌球蛋白II网络。

结论

STORM成像，将有一个直接关系到成功的​​活细胞观察的另一个重要方面是数据采集速度。由于本征时间和空间分辨率之间的折衷，超分辨率成像一般是比较缓慢的。更具体地，构造风暴图像绘制在许多成像帧的检体中的宽视场视图累计本地化。因此，成像速度在风暴需要准备一个高分辨率的图像的帧的数量是有限的。相比之下，聚焦的光点扩散函数的工程技术，如STED，有限的时候需要扫描整个标本的一个小的焦点。因此，单分子技术有望比STED相关的方法要快，成像时，一个大的标本地区，但慢的时候成像面积小。目前，风暴的最高分辨率图像采集时间通常需要几分钟。然而，在60至70纳米的空间分辨率，时间分辨的图像的时间分辨率在活细胞中的几十秒钟的聚集。应该预期将改善与成像速度更快的相机，较高的激发功率，探头具有更快的光控率。