目前大量制备单抗的方法主要有两大系统,一是动物体内生产法,另一是体外培养法。迄今为止,通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法,鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得,因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内,在小鼠腹腔内生长杂交瘤,并产生腹水,因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济,不过,腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括Ig),因此在很多情况下要提纯后才能使用,而且还有污染动物病毒的危险,故而最好用SPF级小鼠。
小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同,有的注射后一周即死亡,有的会出现血性腹水,有的可以反复收取腹水2-3次。一般腹下:
- 每组细胞准备2只小鼠,8-10周龄,最好与制备单抗的小鼠同系;接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂,可以用石蜡油(提前一周)或不完全弗氏佐剂(提前三天);
- 第一只接种细胞数可以控制在106,如果出现腹水少,死得快的现象,则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*105;注射细胞少,腹水形成慢但效价会更高;
- 待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况,如果活力佳,有明显移动性腹水,可以放腹水2次左右;一旦发现小鼠活动受限,要立即处死放腹水;
- 活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器(2-5ml)以及灭菌后的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好,便于离心)。方法就是用酒精棉球擦拭要进针的位置(大概是在腹部中线偏右侧处),而后先让注射器中留点空气而后进针再将注射器慢慢往后推,腹腔中有压力慢慢腹水会往外流,进针时要轻轻向上提一下,感觉无阻碍就好。
- 处死抽取腹水就是用止血钳两把,剪刀小号2把,镊子2把即可。先用剪刀镊子轻轻在小鼠腹腔外皮剪一个小口,而后用两把止血钳轻轻两边拉开,使露出腹部,而后用另一把剪刀、镊子剪开内皮,用枪或玻璃直管即可取腹水。也建议放置eppendorf管中。