做过细胞传代培养(消化法)童鞋可熟知方法,大致可分为传代前准备、胰蛋白酶消化、吹打分散细胞、分装稀释细胞、继续培养这五个步骤,今天我们不具体详解操作步骤,具体谈谈我们实验之前需要注意哪些重要的点:
我们今天讲述的细胞消化传代特指贴壁生长的细胞株培养,在这个过程有几个环节需要注意:
1、胰蛋白酶的选择
有的胰蛋白酶含EDTA,有的则不含,有什么区别呢?
EDTA是一种螯合剂,可以与金属离子结合。含有EDTA的胰蛋白酶除了具有胰蛋白酶的消化作用外,还具有螯合金属离子的作用。
在细胞培养中,含有EDTA的胰蛋白酶,通过螯合细胞表面的钙离子,破坏细胞与细胞之间的黏附作用,从而使细胞分离出来。
因此,如果需要进行细胞解离和分离操作,可以选择含有EDTA的胰蛋白酶;如果只需要进行消化传代操作,可以选择不含EDTA的胰蛋白酶。
2、消化时间的掌握
消化时间的长短会影响细胞的生长和状态。如果消化时间过长,可能会导致细胞死亡或者受损;如果消化时间过短,则可能会导致细胞未能完全分散,影响细胞的生长和分化。
但细胞多长时间能被消化下来,并不完全取决于胰蛋白酶,还和消化的温度、细胞的密度、以及消化环境有关。
通常,37°C下进行消化可以缩短消化时间。我们的胰蛋白酶平时一般放在冰箱内,在消化操作之前,可以提前拿出。
加入胰蛋白酶后,可以把培养瓶放入培养箱内进行消化,这样可以有效缩短消化时间。
另外,不应该在细胞密度太高时才想起来进行消化传代。
当密度太高时,细胞之间的黏连会加剧,此时同等的消化条件,会需要花费更多的时间进行消化,进一步提高了判断消化进度的难度。
比较合理的传代密度应该在70-80%之间。
3、其他注意事项
在加入胰蛋白酶之前,通常会使用pbs进行润洗,润洗后,应该彻底扔弃瓶内的pbs后,再加入胰蛋白酶进行消化。
加入胰蛋白酶的量应该是刚刚没过整个培养瓶底部即可。
在消化过程中,如果发现细胞解离太快,可以把培养瓶竖起来,让瓶壁上残留的消化液进行消化。