类器官与气道类器官概述
类器官（Organoids）是在体外培养形成的、在功能和结构上与体内对应器官或组织相似的3D器官样聚集体。相较于传统的2D细胞培养，类器官因具备体内器官的关键结构与功能特征，在器官发育、疾病建模和毒性检测等方面展现出显著优势。
气道类器官（airway organoids）可由多种类型的细胞建立，如气管、气道基底细胞、肺泡、人诱导多能干细胞（hiPSCs）和胚肺细胞等。由这些细胞培养出的气道类器官三维结构，能重现分化的气道上皮的表型和功能特征，涵盖纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞等，是研究呼吸道病毒病理建模的有力工具。
气道类器官在新冠及流感研究中的作用
2019年底，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）席卷全球，众多医学专家和科研工作者投身于对SARS-CoV-2感染性和新冠肺炎发病机制的研究。研究表明，SARS-CoV-2的刺突蛋白在识别宿主受体血管紧张素转换酶2型（ACE2）、介导病毒进入宿主细胞的过程中起着关键作用。建立气道类器官模型，有助于深入研究呼吸系统中SARS-CoV-2与ACE2的相互作用，以及后续的病毒感染、复制和发病机制等。此外，流感病毒也是全球公共卫生的主要威胁，气道类器官同样可作为预测流感病毒感染性和研究病毒宿主因素的有效工具。
利用康宁产品建立气道类器官的实验方法
实验材料
实验所需材料包括人源支气管上皮细胞、支气管上皮细胞培养基、康宁Matrigel®基质包被3D培养板、类器官专用Matrigel®、Accutase®、Corning Cell Recovery solution、PBS、PneumaCult™ - ALI medium、氢化可的松溶液和肝素。
实验步骤
- 细胞培养：将人源支气管上皮细胞置于支气管上皮细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到70% - 90%。
- 培养板解冻：实验前一天，从储存冰箱（-20℃或更低）中取出康宁Matrigel®基质包被3D培养板，置于0 - 4℃环境下过夜解冻，解冻过程中保持微孔板水平放置。
- 培养板孵育：实验当天，将解冻后的培养板水平放入细胞培养箱，在37℃、5% CO₂的条件下孵育30 - 60分钟，使Matrigel®聚合凝固。
- 细胞消化：移除支气管上皮细胞培养基，用PBS漂洗人支气管上皮细胞，然后使用Accutase将细胞消化成单细胞悬液。
- 细胞富集：将单细胞悬液以1000 rpm的转速在室温下离心5分钟，富集细胞后弃去上清。
- 培养基配制：按照说明书配制PneumaCult™ - ALI Medium，每10 mL预冷的该培养基中添加50 μL氢化可的松溶液和20 μL肝素。
- 类器官培养基准备：在上述配制好的培养基中加入类器官专用Matrigel®，使其终浓度达到0.45 mg/mL。操作时需注意，所有与Matrigel®接触的枪头或容器都要提前预冷，整个过程要将Matrigel®置于冰上。
- 细胞重悬：用步骤7配制的类器官培养基重悬步骤5中的细胞沉淀，将细胞悬液密度调整为1 x 10⁵/mL。
- 细胞接种：从细胞培养箱中取出培养板，向每孔加入80 μL步骤8中的细胞悬液（即8000细胞/孔），然后在37℃、5% CO₂的条件下培养。此接种密度适用于P3人支气管上皮细胞，若使用传代数更低的细胞，可适当降低接种密度；若使用传代数较多的细胞，则可适当提高接种密度。
- 持续培养：连续培养28天，每周更换3次含Matrigel®的培养基（步骤7配制）。
- 类器官收集：移去培养基，每孔加入100 μL Corning Cell Recovery solution，在4℃条件下孵育20 - 30分钟，使Matrigel®解聚。
- 类器官转移与清洗：当类器官从Matrigel®中分离出来后，将液体转移至离心管中，用预冷的PBS清洗孔板底部，并将清洗液合并到之前收集的溶液中，然后瞬时离心，使类器官聚集于离心管底部。收集的类器官既可以用于传代培养，也可用于基因表达分析或免疫染色分析等下游实验。
实验结果与意义
经过28天的连续培养，在康宁Matrigel®基质包被3D培养板的Matrigel表面会形成大量形态相对均一的气道类器官。这些气道类器官由纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞等不同类型的细胞组成，并且在其中检测到了新型冠状病毒受体ACE2和流感受体的表达。通过本文介绍的方法，结合康宁Matrigel基质包被3D培养板，能够培养获得大量均一的气道类器官模型，为快速、高通量地评估呼吸系统病毒的感染性、研究病毒感染机制以及探索潜在的预防手段和治疗策略提供了便捷有效的工具。
