材料与仪器
氯仿 异戊醇 乙醇 矿物油或者一个蜡珠 3mol L NaOAc 5 mmol L MnCl2 突变 PCR 缓冲液 DNA 聚合酶 Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶 高纯度的脱氧核苷 5'-三磷酸 dNTP 混合物 模板 DNA 引物 琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色热循环仪
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂氯仿/异戊醇（24:1，体积比）乙醇，100%矿物油或者一个蜡珠3mol/L NaOAc,pH5.25 mmol/L MnCl21X 突变 PCR 缓冲液70 mmol/L MgCl2500 mmol/L KCl100 mmol/L Tris-HCl,25°C 时 pH8.31g/L 明胶2. 酶和酶缓冲液DNA 聚合酶Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶（Applied Biosystems 或者其他有执照的供应商不要用其他热稳定 DNA 聚合酶替代3. 核酸和寡核苷酸高纯度的脱氧核苷 5'-三磷酸（Pharmacia，USB/Amersham)10XdNTP 混合物，包含 2 mmol/LdGTP、2 mmol/LdATP、10 mmol/LdCTP 和10mmol/LdTTP模板 DNA引物4. 凝胶琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色5. 特殊设备热循环仪二、方法1. 准备 10X 突变 PCR 缓冲液。2. 准备10XdNTP 混合物。3. 准备一个 5 mmol/LMnCl2溶液，不要与 10XPCR 缓冲液混合，否则将产生沉淀干扰 PCR 的扩增。4. 将 10ul 10X 突变 PCR 缓冲液、10ul lOXdNTP 混合物、每种引物各 30pmol 以及20fmol 模板 DNA 混合在一起，用 H20 将总体积补齐至 88ul，然后混匀。5. 添加 10ul 5 mmol/L MnCl2溶液，充分泥匀确保没有沉淀形成。6. 添加 5U(2ul)Taq DNA 聚合酶，将最终体积定为 100ul, 轻轻混匀。如果需要的话，可以覆盖矿物油或一个蜡珠。7. 以 94°C 1 min、45°C1 min、72°C lmin 温育 30 个循环。不要设定热启动步骤，也不要在最后一个循环的末尾设定延长的延伸时间。8. 纯化反应产物，首先用氯仿/异戊醇（24:1, 体积比）抽提，随后用 0.25mol/LNaOAc 和 2.5 倍 100% 乙醇沉淀。9. 将一小部分纯化的产物在琼脂糖凝胶中检测，经溴化乙锭染色后确认全长的产物的量是否令人满意。突变 PCR 应该与标准 PCR 平行进行（忽略上面所列的 4 点不同这两种 PCR 所得到的全长 DNA 的量应该相差不多。
