材料与仪器
限制性内切核酸酶 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 模板 DNA醋酸氨 乙醇 酚 氯仿 T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 dNTP 溶液Sephadex G-50 离心柱 水浴
步骤
一、材料1. 缓冲液和溶液醋酸氨（10 mol/L)乙醇酚：氯仿（1:1，V/V)2. 酶和缓冲液适当的限制性内切核酸酶T4 噬菌体 DNA 聚合酶10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液3. 核酸和寡核苷酸含三种来标记的 dNTP 溶液，浓度各为 2 mmol/L含一种未标记的浓度为 2 mmol/L 的 dNTP 的溶液模板 DNA ( 0.1~5 μg )4. 放射性复合物[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性为 800~3000 Ci/mmol）5. 专用设备Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡预设定至 70℃ 的水浴二、方法1. 用产生平端或 3' 突出端的限制酶消化 0.1~5.0 μg 模板 DNA。2. 用酚: 氯仿抽提及在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化 DNA。3. 将 DNA 沉淀溶于：10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 2 μl2 mmol/L 三种未标记的 dNTP 溶液 1 μl10 mCi/ml [α-32P] dNTP( 800~3000 Ci/mmol） 1 μlT4 噬菌体 DNA 聚合酶（2.5 单位/μl） 1 μl水 加至 20 μl37℃ 温育 5 min。4. 加入 1 μl 2 mmol/L 未标记的第四种 dNTP 溶液，继续温育 10 min。5. 70℃ 加热 5 min 以终止反应。6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的 DNA 与未掺入的 dNTP。
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