材料与仪器
ddH20 Vent 缓冲液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 质粒 DNA PCR 引物琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备 热循环仪
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂ddH202. 酶和酶缓冲液10X Vent 缓冲液Vent DNA 聚合酶3. 核酸和寡核苷酸dNTP，各 20 mmol/LPCR 引物，可以与基因组 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火质粒 DNA(见下面第 1 步）4. 特殊设备琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭 (见第 5 步）热循环仪二、方法1. 在细菌中扩增后，用基因组文库制备的质粒 DNA 建立下列反应。10~50ng 的质粒 DNA50pmol 的各引物5ul 的 10XVent 缓冲液dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul1U 的 Vent DNA 聚合酶用 ddH20 定容至 50ul对下面的每种质粒载体应该分别进行反应：表达载体，没有文库 DNA 插入基因组 DNA 文库的混合物少量 DNA, 由基因组 DNA 文库的单个细菌克隆制备2. 在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。3. 按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。94°C15s55°C10s(或用引物的合适退火温度）72°C40s将最后一次循环的延伸时间延长至 60s。4. 冷却至 4C。5. 取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sambrook and Russell 2001)三、分析在图 26-6 所示的例子中，对文库混合物进行 PCR 分析，其中用的引物是 PmlⅠ位点的侧翼序列，结果显示，文库中含有目的大小的插入片段，但有大量的原始载体的污染 [图 26-6(a), 第 2 泳道]。从文库中选择单个克隆进行 PCR 分析，验证了用文库混合物做模板的结果，显示文库中的原始载体大约占 40%[所分析的 24 个克隆中有 10 个，图 26-6(a), 第 3~26 泳道]。为了提高文库的质量，用 PmlⅠ酶消化文库，然后在细菌中重新进行扩增，以减少原始载体的污染。对文库混合物进行 PCR 分析显示，用 PmlⅠ消化后，无插入的环状载体的污染大大减少了 [图 26-6(b), 第 2 泳道和第 3 泳道]。用 PmlⅠ消化又重新在细菌中扩增后，在文库中随机选择单个克隆进行 PCR 分析，证实无插入 DNA 的出现频率比原始文库大大降低 [20 个克隆中有 0 个，小于 5%，图 26-6(b), 第 4~23 泳道]，并且克隆中含有预计大小的插入片段。对基因组片段文库中的克隆进行 DNA 序列分析显示，文库中含有预计大小的人类基因组 DNA 片段（数据没有列出）。因此，PCR 提供了一个快速、敏感和方便的方法，来分析原始的和改善过的文库。
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