材料与仪器
ddH2O Vent 缓冲液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 引物 质粒 DNA琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备 热循环仪
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂ddH2O2. 酶和酶缓冲液10X Vent 缓冲液Vent DNA 聚合酶3. 核酸和寡核苷酸dNTP，各 20 mmol/L引物，可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火质粒 DNA(见下面第 1 步）4. 特殊设备琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭热循环仪二、方法1.混合以下组分。10~50ng 的质粒 DNA50pmol 的各引物5ul 的 10X Vent 缓冲液dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul1U 的 Vent DNA 聚合酶用 ddH20 定容至 50ul下面的每种质粒载体，应该分别进行反应：未消化载体消化载体，但没连接消化载体，并在无文库 DNA 情况下进行连接消化载体，并用文库 DNA 进行连接2.在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。3.按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。94°C10s55°C10s(或用引物的合适退火温度）72°C15s将最后一个循环的延伸时间延长至 30s4.冷却至 4°C5.取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brook and Russell 2001)。三、分析在图 26-3 所示的例子中，在连接之前进行线性化载体的 PCR 分析，显示载体是完全线性化的，因为没有得到起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 4 泳道）。若不存在文库插入片段，连接载体的 PCR 结果显示发生了一定量的自连（图 26-3, 第 2 泳道），并显示存在一小部分的单切载体。然而，当载体与文库插入片段进行连接后，大部分的 DNA 产物与正确连接的文库 DNA 相对应，而没有与起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 3 泳道）。当载体与插入片段连接后，检测不到起始载体对应的 PCR 产物，但仅用载体连接后能检测到 (比较图 26-3 第 2 泳道和第 3 泳道），可以解释为文库 DNA 连接到了单切的载体上。这一副产物不会形成封闭的环状质粒，不能被克隆，也不会产生 PCR 产物。
在这个例子中，PCR 作为一种重要的分析工具，能够很可靠地验证限制性酶切反应和连接反应。因此，研究者可以用正确的 DNA 进行文库构建的后续步骤，更可能最终获得高质量的文库。通过转化和扩增细菌，可以获得最终的文库，再用标准的程序对质粒 DNA 进行纯化（Sam brook and Russell 2001)。
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