细胞计数与存活测试

1. 原理1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目， 乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。2. 材料2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)2.2. Erythosin bluish stain 取0.1g Erythrosin bluish (Sigma E-9259)及0.05g preservative methyl paraben(Sigma H-3647)溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)2.4. 计数器(counter)2.5. 低倍倒立显微镜2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)3. 步骤3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。4大格细胞总数×2×104/4 = 细胞数/ml*每一大格的体积= 0.1cm × 0.1cm × 0.01cm = 10-4 ml3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。3.5. 范例：T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59死细胞数/方格：5, 3, 4, 6细胞总数= 243平均细胞数/方格= 60.75稀释倍数= 2细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106存活率：225/243﹦92.6 %

内容来源：生物资料网，如果侵权麻烦联系网站工作人员删除！