材料与仪器
双蒸水 RT-PCR 缓冲液 TaqDNA 聚合酶 cDNA dNTP 混合物 基因特异的正向引物 基因特异的反向引物 dCTPPCR 仪 PCR 管 Quantum RNA Universal 18S standards
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂去除 RNA 酶的双蒸水10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)2. 酶和酶缓冲液Taq DNA 聚合酶（5U/ul)3. 核酸和寡核苷酸cDNA(来自方案 1)dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)基因特异的正向引物（5umol/L)基因特异的反向引物（5umol/L)4. 放射性复合物[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(1Ci=37 GBq)5. 实验器材Quantum RNA Universal 18S standards(Ambion; 包括 18SPCR 引物对和 18SPCR 竞争子）薄壁的 PCR 管6. 专用仪器可编程的 PCR 仪二、方法1.引物与竞争子的比例如下。
2.在冰上准备 PCR 反应混合物 。cDNA 5.5ul10XRT-PCR 缓冲液 27.5ul10 mmol/LdNTP 混合物 22ul5U/ulTaqDNA 聚合酶 1.4ul去除 RNA 酶的 ddH2O 177ul[a-32P]dCTP(10uCi/ul) 2.5ul3.平均在每个 PCR 管中加入 42ulPCR 反应混合物，共 5 管，分别标记 1~5。4.在 1~4 管中，分别在每个管中加 2ul 基因特异的正向引物（5umol/L) 和 2ul 基因特异的反向引物（5umol/L)。5.如下所示加入 18SrRNA 引物和竞争子的混合物。在 2 号管中加入 1:9 混合物 4ul在 3 号管中加入 2:8 混合物 4ul在 4 号、5 号管中加入 3:7 混合物 4ul6.进行 PCR 扩增，如方案 1 所述，使用扩增线性范围决定的最佳循环数。7.如方案 1 所述，用变性凝胶电泳来分析实验结果。检测哪一个泳道的 18SrRNA 产物的量最接近基因特异性产物的表达量，这一样品中引物与竞争子的比例在后续的相对 RT-PCR 实验中使用。
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