一、实验目的
采用TUNEL染色技术检测细胞样本中的凋亡水平。
二、实验原理
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180~200bp的DNAladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素标记的dUTP，在DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），从而可以通过显微镜检测细胞凋亡的情况
三、实验材料
1.主要仪器耗材
2.主要试剂
四、方法步骤
1.固定
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用生理盐水浸洗3次；
(2)用4%的多聚甲醛固定爬片15min， 生理盐水浸洗玻片3次；
2.通透
1)蛋白酶K修复：每个样本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37℃反应30 min；
2)PBS浸洗3次各5 min。
3.标记
1)每样滴加50μL的Tunel反应混合物，TdT酶：Biotin-dUTP=1：9配制，37℃避光孵育60min；
2)PBS洗涤1次，滴加反应终止液室温孵育10min；PBS洗涤5min×3次；
3)每个样本滴加50 μLStreptavidin-HRP工作液，湿盒中37℃避光反应30 min；
4)PBS充分浸洗3次各5 min。
4.显色
1)根据说明书配制DAB显色液；
2)每个样本滴加50μLDAB显色工作液，室温显色30s-5min；
3)蒸馏水稍洗终止显色。
5.复染
1)苏木素染色30 s；
2)流水冲洗2 min。
6.分化返蓝
1)1%盐酸酒精分化2 s；
2)流水冲洗切片5 min。
7.干燥封片
1)爬片自然干燥；
2)在载玻片的中央滴加适量中性树胶，将爬片反扣在树胶上封固；
2)在通风橱内室温晾干。
8.镜检
显微镜下观察拍照。
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