酸性磷酸酶重氮盐后偶联法： 与碱性磷酸酶相同。重氮化和偶联反应多在碱性溶液中和低温条件下进行。在酸性溶液中容易分解。所以酶作用与偶联反应分两步进行。 1)孵育液配制 磷酸―6―苯酰-2-萘钠 25rug 蒸馏水 80ml Wapoll醋酸缓冲液(pH 5．0) 20ml 氯化钠 2g 重氮盐溶液配制： 坚牢蓝B盐 50rug 蒸馏水 50ml 加碳酸氢钠使之碱化。 2)染色程序： ①用新鲜或冷福尔马林固定的组织进行恒冷箱切片： ②切片人孵育液中，室温孵育10―60分钟(新鲜组织切片)，或1～2小时(固定后组织切片)； ③新鲜组织切片用冷生理盐水洗3次，固定后的组织切片用蒸馏水洗3次； ④放人新鲜配制的冷重氮液中，搅动3～5分钟； ⑤用冷生理盐水或蒸馏水洗3次，每次5分钟； ⑥甘油明胶封固。 3)结果：酶活性部位显示蓝色。 4)对照实验：与铅法相同。
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