主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析
两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较
RT-PCR主要用途 分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针 逆转录酶的选择 AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和 RNA 酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶， RNA 酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛）Super RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的 RNA 转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）RNase H的作用水解 RNA -DNA杂合链中的 RNART-PCR引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡 结构的 RNA ,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。Oligo(dT15-18)：适用于具有PolyA尾巴的 RNA 。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。提高RT-PCR灵敏度1.分离高质量 RNA2.使用无RNaseH活性的逆转录酶3.提高逆转录酶保温温度4.减少基因组DNA污染 RT常见问题
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