一、RNA干扰分子机制解析
1. 双链RNA识别与加工
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Dicer酶的作用机制
RNase III家族成员Dicer通过ATP依赖性识别双链RNA（dsRNA），切割生成具有3'端2碱基突出的21-23nt siRNA片段。该过程包含两步切割：
① 初级dsRNA的3'端逐步切割
② 生成具有5'磷酸和3'羟基的双链siRNA -
植物特异性调控路径
启动子区dsRNA可被加工为21-23nt片段，通过DNA甲基化修饰沉默同源基因，形成表观遗传调控。
2. 基因沉默执行系统
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RISC复合体组装
siRNA与Argonaute蛋白结合形成RISC，通过ATP依赖性解旋过程释放引导链。 -
mRNA靶向切割
RISC复合体通过碱基配对定位同源mRNA，在距离siRNA 3'端12nt处切割，该过程涉及未明确的核酸酶活性。
二、RNAi实验技术体系
（一）siRNA设计策略
1. 序列筛选原则
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靶点选择标准
- 起始密码子下游优先（避开UTR区）
- GC含量45%-55%（Tuschl规则）
- 独特序列（BLAST验证）
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2. 对照实验设计
- 阴性对照构建
采用序列打乱（scrambled）或异源物种对照，需验证其与实验体系的无关性。
（二）siRNA制备方法对比
| 方法 | 原理 | 适用场景 | 技术优势 | 局限性 |
|---|---|---|---|---|
| 化学合成 | 直接合成双链siRNA | 确认有效序列后的规模化制备 | 高特异性 | 成本高 |
| 体外转录 | T7 RNA聚合酶合成发夹RNA | 多序列快速筛选 | 成本低（1/10化学合成量） | 产量限制 |
| RNase III消化 | 长dsRNA体外切割 | 快速功能研究 | 节省筛选时间 | 可能脱靶 |
| 表达载体 | U6/H1启动子驱动shRNA | 长期基因沉默 | 稳定表达 | 克隆耗时 |
| SECs（表达框架） | PCR扩增pol III表达盒 | 高通量筛选 | 1日完成构建 | 转染效率低 |
（三）实验优化要点
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转染效率提升
- 使用脂质体（Lipofectamine）或阳离子聚合物
- 优化siRNA浓度（20-100nM）与细胞密度
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效果验证体系
- WB检测蛋白水平
- qRT-PCR验证mRNA降解
- 功能表型分析（如细胞增殖、凋亡检测）
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脱靶效应控制
- 使用多个非重叠siRNA验证
- 结合CRISPRi/a系统互补验证
三、技术发展趋势
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新型递送系统
- 纳米颗粒载体（LNP）
- 组织特异性靶向修饰
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高通量筛选平台
- 全基因组siRNA文库
- 智能算法辅助设计（如DeepDesign）
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临床转化研究
- siRNA药物（如Patisiran）
- 基于外泌体的体内递送
