人类淋巴母细胞建株要点

l、4ml肝素抗凝血于离心管中,加入2ml RPMI 1640。 2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。 3、1500rpm,15min,吸取白细胞层(第二层)于另一离心管中。 4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。 5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中,加入10μl环胞霉素和100μl的EBV(EB病毒)液,混匀。 6、水浴摇床,40次/分,37℃,3hr。 7、1500rpm,15min。将细胞接种至1ml培养基中(内含谷氨酰胺1mM/ml)加入10μl环胞霉素,轻轻混匀,37℃培养。 8、5天后观察细胞转化和生长情况,决定是否半量换液。一般半量换液l—2次,并维持环胞霉素的浓度。 9、待转化细胞数量明显上升,并出现细胞团块后,可转入25ml细胞培养瓶中,加1—2ml培养基,37℃培养10—15天,一般每隔3—4天观察一次,决定是否换液,传代。 10、细胞生长达一定数量后冻存,冻存前应进行核型分析和存档。

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