人和哺乳动物原代细胞的蛋白质抽提步骤

一、培养的贴壁原代细胞的蛋白质抽提基本步骤

1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。

2、预冷的1×PBS(pH 7.4)清洗贴壁的细胞2次,小心倾去PBS。

3、PriCells蛋白质抽提试剂(1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等)。

4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂(107 个细胞中加入1ml抽提试剂;5×106 个细胞中加入0.5ml抽提试剂),轻轻摇动5分钟。

5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来,转移细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动15分钟进行裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14,000×g离心15分钟。弃去沉淀,上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用(-80o C或液氮中)。

二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤

1、2500×g离心10分钟沉淀悬浮的细胞,弃去上清液。

2、预冷的1×PBS(pH 7.4)悬浮沉淀细胞,2500×g离心10分钟沉淀细胞,去上清。

3、PriCells蛋白质抽提剂(1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等)。

4、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂(107 个细胞中加入1ml抽提试剂;5×106 个细胞中加入0.5ml抽提试剂),轻轻摇动5分钟

5、细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动15分钟进行裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14,000×g离心15分钟。弃去沉淀,上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用(-80o C或液氮中)。

三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤

1、组织称重,切小块放入管中。

3、PriCells蛋白质抽提剂(1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等)。

3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂(250mg组织中加入1ml抽提试剂)。

4、用匀浆器每次30秒低速匀浆,每次匀浆间隔冰浴1分钟,至组织完全裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14,000×g离心15分钟。弃去沉淀,上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用(-80o C或液氮中)。

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