ras2抑制基因的分离实验

材料与仪器

酵母菌株FY 86 DAY229 DAY230质粒文库DNA 乙酸裡 PEG3350 大肠杆菌细胞 葡萄糖 EDTA SDS TE 缓冲液YPD 平板 无菌绒垫 96孔板 微离心管

步骤

第 1 天 典型抑制基因搜寻 指导老师已经在一对YPD 平板上划出了 突 变 株 （ 菌株8-2供 1、 2、 3、 4 组使 用 ；菌 株 8-3供 5、 6、 7、 8 组使用）。 用 YPD 平板，接 30〜40个单菌落作为原始平板，每个菌落约占1cm2, 30°C 下培 养。完成原始平板划线后，用一块划线平板与使用具有对应匹配的突变搜寻菌株的实验 组交换一块平板，将这块平板冷藏备用。 高拷贝抑制基因搜寻： r a d 突变株于5mlYPD液体培养基中30°C过夜培养。 第 2 天 典型抑制基因搜寻 将 YPD原始平板先后影印到一块YPD平板和两块YPAc平板上，轻轻地影印使背 景生长减少到最小限度。给指导老师一块影印平板供紫外线处理（ 使 用 Stratalmker， 7500“）。两平板在30°C培养。 高拷贝抑制基因搜寻 上午，将 5 0 0 4 静止的r a d 突变株液体培养液稀释到装有50ml YPD 的锥形瓶中， 培 养 6〜7h 直到细胞密度约为2 X 107 个/ml。完 成 9 个转化，每个转化使用ljugYEp URA3 文库DNA; 另一个对照转化使用lpg Yep24 DNA。将转化后的菌液涂在10块 Cas-ura+ 乙酸盐平板上，在 30°C培养。 第 6 天 典型抑制基因搜寻 可见小菌落长出，统计诱变平板和未诱变平板上的小菌落数量。从经紫外线处理或 未经处理的平板中挑取单个菌落并转接到一个新鲜Y P D 原平板，挑 取 15〜30个小菌 落。小心挑取以免周围细胞的污染（ 正规的方法将通过单菌落划线纯化小菌落，为了节 约时间省略这些步骤）。每批编号，并记录小菌落来自哪个平板（ 紫外线处理或未处理 的），包括不同批的亲本菌株和在原平板的i^A S S 对照菌株8-6,在 30°C下培养。 将 从 邻 组 得 到 的 菌 株 （ 菌 株 8-2供 1、 2、 3、 4 组使用；菌 株 8-3供 5、 6、 7、 8 组使用）于 5m lY P D 培养基中培养。 第 7 天 典型抑制基因搜寻 从 5ml过夜培养物中取20〇 4细胞均匀地涂在一块SC-his-trp平板上；将该平板置 于水平表面，使其表面干燥。 将 YPD原平板分别影印到2 块 YPAc平板、 2 块 YPD平板和事先准备好的、 长有ras2 菌苔的SC-his-trp平 板 上 （ 确定这一步最后做）。一 块 YPAc平 板 和 YPD平板于 3〇 °C下培养，其余于37°C下培养，杂交平板于30°C下培养。 第 8 天 典型抑制基因搜寻 记 录 30°C和 37°C的菌落生长情况，保 存 30°CYPD平板备第12天使用。选择欲作 详细分析的12个 回 复 突 变 型 （ revertant)，把 这 12个回复突变型与培养在SC-his-trp 平 板 上 的 菌 株 交 叉 划 线 ，同时也把r a d 亲本与r a d 菌株交叉划线，每个平板可以 划 4〜6 个交叉。这些平板置于30°C下培养。 高拷贝抑制基因搜寻 此时转化平板上已有菌落长出。挑 取 8 个菌落，接种到2mlCaS-um 液体过夜培养 物中，小心挑取以免挑到转化平板上周围的细胞。同时，使 用 1/4的 Y PD 平板将每个 菌落作单菌落划线，于 30°C下培养这些平板。注意，正规的方法应在这步之前使用一 块新鲜平板纯化菌落，为了节约时间省略这些步骤。 第 9 天 高拷贝抑制基因搜寻 按 “技术和方案3C， lOmin制备酵母DNA” ，使 用 2m l过夜培养物，从携带有高 拷贝抑制基因的菌株中分离DNA。取 5^1转化适当的大肠杆菌，在 LB+ Amp平板上 涂板。 第 1 0 天 典型抑制基因搜寻 为了测定抑制基因是显性还是隐性，从每块SC-his-trp划线平板上挑取2 个单菌落 (双倍体）， 分别涂于Y PA c和 Y P D 平板，同 时 还 应 包 括 亲 本 与 菌 株 交 叉 划 线平板上的一个菌落。平板于30°C下培养。 高拷贝抑制基因搜寻 从大肠杆菌转化子中挑取每一个高拷贝基因的一个菌落，于 5ml LB+ Amp培养基 中，在 37°C下开始过夜培养。将抑制基因的YPD 划线平板影印到2 块 5-F0 A 平板上， 以选择丢失了高拷贝抑制基因质粒的细胞。这些可以被用来确定抑制作用是依赖于质粒 的存在的。 第 1 1 天 高拷贝抑制基因搜寻 少量抽提高拷贝抑制基因的质粒DNA，按 “技术和方案2， ‘ 快速和简略的’ 酵母 菌落质粒转化法”将 质 粒 D N A转 人 突 变 菌 株 中 。将每个转化产物的一半涂于 Cas-um平板上，另一半涂于Cas-ura+ 乙酸盐平板上，于 30°C下培养。同时还应包括 一 个 ljugYep2 4 D N A的对照转化，将转化产物的一半涂于Cas-ura平板上，另一半涂 于 Cas-ura+ 乙酸盐平板上。实 验 八 抑 制 基 因 的 分 离 第 1 2 天 典型抑制基因搜寻 统计Y PD 和 Y PA c平板上的菌落生长情况，测定哪些抑制基因是显性的，哪些是 隐性的。取出第8 天保存的YPD 平板，在平板上用m泛亲本菌株和8〜10个隐形抑制 基因菌株做平行划线，作为划线原始平板（ 附录D，平板划线模板），于 30°C下培养^ 高拷贝抑制基因搜寻 为了鉴定带有i?AS2 基因的抑制基因，以每一个高拷贝抑制基因少量抽提的DNA 作为模板设计一下多聚酶链式反应（ PCR): lpl 1 : 10稀释的少量抽提的DNA 5M1 lOXTaq缓冲液 5jul 2mmol/L dNTP 混合物 5jul 5ymol/L DAo-RAS2-l 引物 5 4 5|umol/L DAo-RAS2-2 引物 ljul Taq 28^1 H 20 使用以下 PCR 参数： 94°C ， 4min—94°C ， lmin， 25 个循环—55°C ， 1〇 1丨11->72。 (：， 1. 5min—72°C ， 20min—4°C长时间保温。 每个PC R 反应取5jul上样于1% 的琼脂糖凝胶，由指导老师提供的i?AS2 阳性反应 作对照。如果抑制基因带有i?AS2 基因，则预期将看到约为1.5k b 的 PC R 产物。那些 不带有i?A S2 基因的质粒将被送去测序，使 用 DA〇-YEp24-l 和 DA〇-YEp24-2引物， 可鉴定质粒中文库插人片段的末端序列。 将 第 10 天 的 5-FO A平板影印到2 块 Y PA c平板上，于 30°C下培养。 第 1 3 天 典型抑制基因搜寻 为了设计隐性抑制基因的互补组分析，将 第 12天的划线原始平板影印到2 块 YPD 平板，标记好划线。用一块划线原始平板与使用对应杂交型菌株开始抑制基因搜寻的小 组交换一块平板，于 30°C下培养。 第 1 4 天 典型抑制基因搜寻 为了进行互补组分析需做杂交实验，将两块划线平板中的一块平板以垂直正交的方 式影印到另一块新鲜的YPD 平板上，于 30°C下培养。 第 1 5 天 典型抑制基因搜寻 将 第 14天的交叉划线平板影印到一块SC-his-trp平板上，于 30°C 下培养以为互补 则验筛选双倍体。第 1 6 天 典型抑制基因搜寻 从 SC-h1S-trp平板上划线重合区挑取菌体，在 SC-his-trp平板上做划线原始平板。 第 1 7 天 典型抑制基因搜寻 将 第 16天的划线平板（ SC-his-trp) 影印到Y P A c和 YPD 平板，于 30°C下培养。 高拷贝抑制基因搜寻 统计第12天影印到Y PA c平板上的丢失高拷贝抑制基因质粒的菌株。如果这些菌 株在YPA c平板上生长出来，则抑制作用不是质粒依赖的，菌株中的质粒不是我们感兴 趣的。 统计高拷贝抑制基因允许m泛 突 变 株 在 乙 酸 盐 培 养 基 上 生 长 的 能 力 。注意， YEp24对照菌株本应在Cas-um培养基上生长，而在CaS-ura+ 乙酸盐培养基上不生长。 如果事实上候选质粒是高拷贝抑制基因，那么它将使所有转化的细胞能在乙酸盐培养基 上生长。此时，可能已经获得了抑制基因质粒中插入片段的末端序列了。使用酵母基因 组数据库(http://www.pathway,yeastgenome.org/)确定基因组基因座和负责抑制作用 的区域中的潜在基因。在你自己的实验室中，单个的幵放可读框将被亚克隆到2ju质粒 上 ，再 次 检 测 基 因 的 高 拷 贝 抑 制 基 因 ，以确定真正的抑制基因。 第 1 8 天 典型抑制基因搜寻 统计第17天的平板上双倍体菌落的生长情况。你期望无法互补的抑制基因将会产 生什么样的表型？你的突变子中是否有和来自邻组的突变子属于同一互补组？你有多少 互补组？

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