winniw214

有一个蛋白，我想把它denature之后再进行refolding。（这样可以加入一些调节因子之类的）我想问问具体的方法。网上搜到的都语焉不详。最好有buffer配方和步骤。有相关参考文献也好。谢谢！！蛋白大小为27kD.N端亲水，C端疏水。全蛋白不溶

zhujoker

请参考以下两个链接：http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=F5674C5F-898D-4BA7-8514-CE57D20F7018http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Protein_Refolding/NOVAGEN_Protein_Refolding_kit.pdf应该对你有用！

winniw214

谢谢版主不过我们是用的尿素洗柱的，用GuHcl的效果不好。如果是Urea，要怎么refolding呢？谢谢！

woxingwosu

如果你是用8M urea来denature，那么可以采用逐步减少urea concentration来达到refolding的效果，具体可以： 8M， 6M, 4M, 2M最后去掉urea。通常情况下在4M的时候蛋白质已经开始refolding了。这个逐步减少Urea的方法可以通过透析来实现，最好在4度，避免沉淀出现。需要找到合适孔径的透析袋，太大了蛋白就被透析出去了。顺便提供一下我的refolding buffer的配方把，也蛮简单的，50 mM Tris buffer at pH 8.0（一般认为tris的效果比较好），然后把不同浓度的urea按照量加进去就可以了，但是效果不错的，可以试试。还有其他的refolding方法，包括稀释复性，超滤等等，但是我觉得还是透析的最好，不增加原溶液体积，效果也不错。如果楼主需要的话，也可以讨论一下。希望能帮到楼主。

xiuqyang

我认为你用urea和pH双梯度复性较好，可以参阅一篇文献

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