试剂: 试样20μl DNA ladder 琼脂糖 TAE缓冲液 上样缓冲液
含0.5μg/ml EB的电泳缓冲液
50×TAE贮存液: Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5mol/LEDTA(pH 8.0) 100ml
双蒸水 至1L
1×TAE 工作液: 40mmol/L Tris-乙酸盐
1mmol/L EDTA
0.8%琼脂糖凝胶: 琼脂糖 0.8g
TAE 100ml
器械 250ml锥形瓶+纸盖子+棉线绳 50ml量筒 白枪头 30μl枪 5μl枪
微波炉 电泳仪(梳子,制胶板) 凝胶成像仪
准备
1. 250ml锥形瓶,超生清洗,烘干.
2. 打开电子天平,预热.
3. 清洗制胶板,梳子,电泳槽.
步骤
1. 按配方配制TAE.
2. 250ml锥形瓶中,按配方加入琼脂糖和TAE,摇匀. (60ml+0.48g)
用棉线绳扎紧纸盖子,盖子上要扎眼透气.缓冲液体积要小于容器体积的50%.
3. 微波炉,中火加热,不停观察,最短时间内,至琼脂糖完全融化.
4. 待胶稍冷,约60℃,倒入制胶板中.厚度3-5mm.
5. 插入梳子.梳子应在地面上0.5-1mm.
6. rt,30-45min.凝胶完全凝结.
7. 倒入少量电泳缓冲液在凝胶顶部,小心拔出梳子.到处缓冲液.将凝胶放入电泳槽中.
8. 向电泳槽中加入缓冲液,刚好没过凝胶1mm.
9. 取约5μl上样缓冲液,与20μl试样/DNA ladder,分别混合均匀.
10. 将上述混合液,加至加样孔中. DNA ladder应在最左/右侧.
11. 关上电泳槽盖,接好电源.使DNA从负极(黑)向阳极(红)移动.
12. 给予60-70V电压. (1-5V/cm)
13. 待缓冲液前延至胶的2/3时,关闭电源,拔出电极插头,打开电泳槽盖.
14. 小心取出凝胶,放入0.5μg/ml的EB液中,浸染30min.
15. 于凝胶成像仪,312nm,观察,摄像.
注意:
1. 配胶和灌满电泳槽要使用同一批缓冲液.因为离子强度或pH很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱,严重影响DNA泳动.
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