人Alpha干扰素对灵长类动物细胞系的相对抗病毒活性，小鼠Alpha干扰素对仓鼠和大鼠细胞系的相对抗病毒活性。
Thomas B. Lavoie, Sara Crisafulli Cabatu, Jessica Esposito, Karlene Moolchan, Lara Izotova, Sidney Pestka. PBL InterferonSource, 131 Ethel Rd West, Piscataway, NJ 08854 USA.
摘要
I型IFN亚型通常具有相对的物种选择性，这使得跨物种实验难以解释。叙利亚金仓鼠和挪威大鼠是常见的啮齿动物模型，恒河猴和食蟹猴这两种猕猴是常见的非人类灵长类动物模型，可用于多种病毒感染。来自这些物种的Alpha干扰素亚型大多不可用，因此在这些模型系统中经常使用小鼠或人类IFN亚型。为了了解哪些小鼠或人Alpha IFN亚型可用于跨物种实验，我们建立了恒河猴（LLC-MK2/VSV）、蟹猴（JTC-12/EMCV）、叙利亚金仓鼠（bkh -21/VSV）和挪威大鼠（C6/VSV）细胞系的抗病毒细胞病变效应抑制实验。在仓鼠和大鼠细胞上测试了所有14种小鼠Alpha -IFN，在恒河鼠和食蟹细胞系上测试了所有12种人类亚型Alpha -IFN。一般来说，大多数小鼠IFN - Alpha亚型在其他啮齿动物细胞上表现出活性，而大多数人类IFN - Alpha亚型在猕猴细胞上表现出活性。然而，有几个值得注意的例外，某些亚型在跨种分析中很少或没有活性。本研究结果可用于鉴定和选择最适合用于相关动物模型系统的人类和小鼠IFN- Alpha亚型。
介绍
哺乳动物的I型干扰素系统似乎是高度冗余的。这个系统包括各种物种的beta, epsilon, kappa, zeta 和tau。IFN-Alpha家族在大多数哺乳动物中特别大，人类有12个成员，小鼠有14个，大鼠有18个。这种冗余的原因尚不清楚，也是许多研究的主题。
仓鼠、大鼠、恒河猴和食蟹猴常被用作各种可能用干扰素治疗的疾病的模型。没有仓鼠的IFN-Alpha亚型是现成的，只有一个大鼠，恒河猴和食蟹的IFN-Alpha亚型是可用的。
所有的人类亚型和几种小鼠亚型都可以在市场上买到，但关于哪些亚型可能在跨物种方式中发挥良好作用的数据很少。
我们在这些物种衍生的细胞系中检测了多种人类和小鼠IFN-Alpha亚型的抗病毒作用，以努力了解哪些亚型可能适合特定的实验。
方法
细胞系和病毒。小鼠成纤维细胞L929 （CCL-1）、仓鼠成纤维细胞BHK-21 （CCL-10）、大鼠成纤维细胞C6 （CCL-107）、人上皮细胞A549和恒河猴上皮细胞LLC-MK2 （CCL-7）细胞系均来自ATCC （Manassa, Va）。食蟹蟹上皮JTC-12 （JCRB0607）细胞系来自日本东京HSRRB。A549和JTC-12细胞的维持采用含10% FBS （Invitrogen）的DMEM。用10% FBS （Invitrogen）的Eagles MEM维持L929、BHK-21和LLC-MK2细胞，用10% FBS （Invitrogen）的F12K维持C6细胞。脑心肌炎病毒（VR-129B）和水疱性口炎病毒（VR-1238）也来自ATCC，并在Vero （CCL-81）中培养。
小鼠IFN-Alpha亚型的克隆与纯化。所有Mu IFN-Alpha基因（表1）以密码子和mRNA优化形式合成，并在大肠杆菌中表达。它们是用热休克促进剂系统表达的。包涵体中发现的单个IFN-Alpha成熟蛋白用胍氯变性，稀释后重新折叠，使用色谱方法（离子交换、施胶和疏水相互作用色谱相结合）纯化至bb0 95%纯度（图1）。
人类IFN-Alpha亚型均来自PBL InteferonSource库存。
细胞病变效应试验（CPE）。所有实验都是通过将细胞镀在微滴板中，使其粘附2-4小时，然后添加测试干扰素来建立的。孵育过夜后，加入EMCV或VSV的稀释液。24-48小时后，观察不含IFN的孔的细胞病变效应。实验中使用的病毒原液的稀释浓度是在时间框架内杀死90%至100%细胞的稀释浓度的2-4倍。活细胞用结晶紫染色，并用自来水洗去多余的染料。干燥至少2小时后，用70%甲醇溶解染料，在Molecular Devices UVMax测板仪中测定562 nm处的吸光度。抑制CPE的计算方法是，将有病毒孵育但不含IFN的细胞设为100%抑制（病毒对照），将无病毒孵育的细胞设为0%抑制（细胞对照）。两种对照均使用了6孔。通常细胞对照值是病毒对照值的6-10倍。所有样品数据点在两个孔中至少进行两次独立分析。
表1：本研究中使用的小鼠IFN基因和蛋白
| IFN Gene | PBL Cat. # | GenBankAccession #mRNA | GenBankAccession #Protein | Mouse Strain |
| IFNA1 | 12105-1 | AY225950 | AA063592 | C57BL/6 |
| IFNA2 | NYA | X01969 | CAA26002 | BALB/c |
| IFNA4 | 12110-1 | AY220463 | AA064456 | 129/Sv |
| IFNA5 | NYA | AY220464 | AA064457 | 129/Sv |
| IFNA6T | NYA | AY220465 | AA064458 | 129/Sv |
| IFNA7/10 | NYA | M1310 | AAA37888 | Swiss |
| IFNA8/6 | NYA | AY225953 | AA063595 | C57BL/6 |
| IFNA9 | NYA | M13660 | AAA37886 | BALB/c |
| IFNA11 | 12125-1 | AY225954 | AA063596 | C57BL/6 |
| IFNA12 | NYA | AY225951 | AA063593 | C57BL/6 |
| IFNA13 | 12130-1 | AY220461 | AA064454 | 129/Sv |
| IFNA14 | NYA | AY220462 | AA064455 | 129/Sv |
NYA表示尚未提供。
图1：纯化的Mu IFN-Alpha蛋白纯度为95%。
纯化后的小鼠IFN-Alpha亚型（0.3 ~ 10 mg/L细菌培养）的表达量和产率不同。小鼠IFN-Alpha12、13、14、6T和B分别以每泳道3和1?g的浓度在12.5% SDS-PAGE上负载。
图2：EMCV攻毒L929细胞的标准CPE试验
PBL实验室标准品（Mu IFN-Alpha a）已被校准为NIH小鼠IFN-Alpha标准品（Ga02-901-511）。
图3：小鼠IFN-Alpha12、小鼠IFN-Alpha14和大鼠IFN-Alpha1对VSV侵袭大鼠C6细胞的保护作用。
大鼠Alpha 1 IFN（pbl# 13100）对VSV攻击的大鼠C6细胞的抗病毒活性与小鼠Alpha 12和14进行了比较。
图4：小鼠IFN-Alpha6T、小鼠IFN-Alpha13和人IFN-Alpha2a对叙利亚金仓鼠BHK-21细胞VSV攻击的保护作用
图5：不同实验小鼠IFN-Alpha亚型活性的比较
表2：小鼠IFN-Alpha蛋白对L929、C6和BHK-21细胞抗病毒活性的比较
| IFN Subtype | L929/EMCV | RatC6/VSV | Hamster BHK-21 |
| IFN-Alpha1 | 3.50E+07 | 3.80E+07 | 1.10E+08 |
| IFN-Alpha2 | 2.50E+07 | 1.90E+07 | 1.20E+06 |
| IFN-Alpha4 | 3.00E+07 | 3.10E+07 | 1.80E+05 |
| IFN-Alpha5 | 2.10E+07 | 1.50E+06 | NT |
| IFN-Alpha6T | 2.00E+07 | 6.00E+06 | 5.00E+08 |
| IFN-Alpha7 | 6.00E+06 | 5.10E+07 | 2.60E+08 |
| IFN-Alpha8 | 1.70E+08 | 2.70E+08 | NT |
| IFN-Alpha9 | 2.00E+08 | 6.50E+06 | 9.20E+08 |
| IFN-Alpha11 | 8.50E+07 | 1.50E+08 | <1.1e+6 |
| IFN-Alpha12 | 1.60E+08 | 1.80E+07 | 6.00E+07 |
| IFN-Alpha13 | 3.40E+07 | 1.10E+08 | 5.70E+07 |
| IFN-Alpha14 | 1.10E+08 | 7.90E+07 | 1.80E+08 |
| IFN-AlphaA | 4.60E+07 | 6.50E+06 | <1e76 |
| IFN-AlphaB | 3.70E+08 | NT | 8.90E+08 |
在小鼠L929细胞上，小鼠IFN-Alpha 8、9、12、14和B的活性最高。在大鼠C6细胞中，IFN-Alpha 8、11、13的活性最高；在仓鼠BHK-21细胞中，IFN-Alpha 6T、7、9、14和B的活性最高。
总的来说，小鼠IFN-Alpha 1,13,14和B表现出最好的跨物种反应性。因此，这些将是跨物种研究的选择。
表3：本研究中使用的人类IFN基因和蛋白质
| IFN Gene | PBL Cat. # | GenBankAccession #DNA | GenBankAccession #Protein |
| IFN-Alpha1b | 11125 | V00538 | CAA23799 |
| IFN-Alpha2a | 11100 | V00549 | CAA23810 |
| IFN-Alpha4a | 11177 | NM02168 | NP 066546 |
| IFN-Alpha4b | 11180 | X02955 | CAA26701 |
| IFN-Alpha5 | 11135 | X02956 | CAA26702 |
| IFN-Alpha6 | 11165 | X02958 | CAA26704 |
| IFN-Alpha7a | 11160 | X02960 | CAA26706 |
| IFN-Alpha8b | 11115 | X03125 | CAA26903 |
| IFN-Alpha10a | 11120 | NM002171 | NP 002162 |
| IFN-Alpha14c | 11145 | V00533 | CAA23794 |
| IFN-Alpha16 | 11190 | X02957 | CAA26703 |
| IFN-Alpha17a | 11150 | J00216 | AAA52723 |
| IFN-Alpha21a | 11130 | V00540 | CAA23801 |
图6：选定的人IFN-Alpha亚型对A549细胞的活性
图7：选定的人IFN-Alpha亚型在恒河猴LLC-MK2细胞上的活性
图8：人、恒河猴和食蟹干扰素Alpha序列的关系
图9：人IFN-Alpha亚型在人和猴细胞上活性的比较
表4：人IFN-Alpha蛋白对人、恒河猴和食蟹细胞抗病毒活性的比较
| IFN Subtype | A549/EMCV | LLC-MK2/VSV | JTC-12/VSV |
| Gene | Cat # | DNA | Protein |
| IFN-Alpha1b | 1.10E+07 | 2.90E+08 | 4.60E+08 |
| IFN-Alpha2a | 3.30E+08 | 3.30E+08 | 3.30E+08 |
| IFN-Alpha4a | 1.80E+08 | <1e6 | 3.80E+08 |
| IFN-Alpha4b | 1.70E+08 | <2e6 | 2.80E+08 |
| IFN-Alpha5 | 7.10E+08 | 6.20E+08 | 4.60E+08 |
| IFN-Alpha6 | 2.70E+08 | <2e6 | 3.20E+08 |
| IFN-Alpha7a | 1.80E+08 | <2e6 | 3.30E+08 |
| IFN-Alpha8b | 4.10E+08 | 2.00E+09 | 2.20E+10 |
| IFN-Alpha10a | 3.50E+09 | 4.20E+09 | 1.40E+09 |
| IFN-Alpha14c | 3.40E+08 | 1.20E+09 | 3.40E+07 |
| IFN-Alpha16 | 2.20E+07 | 8.90E+09 | 2.30E+07 |
| IFN-Alpha17a | 3.30E+08 | 5.30E+08 | 1.00E+09 |
| IFN-Alpha21a | 1.10E+08 | 1.30E+08 | 1.40E+09 |
人类IFN-Alpha2、5和10似乎在细胞系中具有一致的活性。IFN-Alpha1对猴细胞有较高的活性。
结论
我们已经检测了小鼠和人类IFN-Alpha亚型保护异源细胞免受病毒攻击的能力。
一些亚型在物种之间表现出非常明显的缺乏交叉反应性。
IFN-Alpha A是最容易获得的小鼠IFN-Alpha亚型，对大鼠和叙利亚金仓鼠细胞的活性相对较低。
小鼠IFN-Alpha 5、9和12对大鼠细胞的活性较弱，而至少9和12对仓鼠细胞的活性较好。
人IFN-Alpha4a、4b、6和7对恒河猴细胞的活性较弱，而对食蟹细胞的活性较好。
一些IFN-Alpha亚型确实适合于涉及多物种的实验工作。
小鼠IFN-Alpha1和IFN-Alpha 11具有良好的跨种活性。
人类IFN-Alpha2、5和10在被试物种中具有良好的反应性，尤其是IFN-Alpha10对所有被试细胞都具有非常强的活性。
这一结果有些有趣，因为恒河猴和食蟹猴的基因组都不包含与人类IFN-Alpha10序列明确同源的基因。
