原理
几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。
材料与仪器
红豆杉细胞丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺 SuperscriptTMⅡ试剂 柠檬酸钠 Taq DNA聚合酶 dNTPs 十二烷基肌氨酸钠 巯基乙醇 RNAimage试剂盒 异硫氰酸胍 焦碳酸二乙酯基因扩增仪 凝胶成像系统 超低温冰箱 电热鼓风干燥箱 超净台 脱色摇床 核酸定量仪 多用电泳仪 DNA序列分析电泳槽
步骤
一、实验材料1. 红豆杉细胞未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。2. 寡核苷酸引物（1）3’锚定引物：①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’（2）5’ 随机引物：Kit引物：①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’生工引物：①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’特异引物：①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’二、 实验方法2. 总RNA的提取与检测（1）用品的准备塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。（2）试剂的配置① CSB缓冲液42 mmol/L 柠檬酸钠（Sodum citrate）0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸钠（N-lauryl sarcosine）0.2 mmol/L 巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）（3）RNA提取对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取，提取步骤如下：① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液，冰浴5分钟。② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200 ul β-巯基乙醇，振荡混匀。③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠（pH4.0），充分混合。④ 加入10 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。⑤ 加入2 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。⑥ 4℃，12 000 g，离心20分钟。⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。⑧ 加入6 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。⑨ 加入6 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。
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