材料与仪器
PCR 缓冲液 ddH20 基因组 DNA dNTP 寡核苷酸引物离心机和转子 丙烯酸防护板 过滤阻挡吸头 多道移液器 PCR 仪 托盘 固定器装置 底座管盖小管
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂含 15 mmol/LMgCl2的 10XPCR 缓冲液 (GeneAmpPCR 缓冲液 I，AppliedBiosystems)灭过菌的 ddH202. 酶和酶缓冲液TaqDNA 聚合酶，(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)3. 核酸和寡核苷酸基因组 DNA10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物，AppliedBiosystems)寡核苷酸引物（Invitrogen 公司合成，稀释成 lOumol/L)4. 离心机和转子用翻转吊桶式转子和微板适配器离心5. 专用设备丙烯酸防护板（acrylicshield)过滤阻挡吸头（filterbarriertips)多道移液器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)PCR 仪，96 孔（AppliedBiosystemsGeneAmp9700)托盘/固定器装置和底座，96 孔（AppliedBiosystems)管盖，一条 8 个（USAScientific 或 AppliedBiosystems)小管，0.2 ml，一条 8 个（USAScientific 或 AppliedBiosystems)二、方法1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 缓冲液和未标记的引物。Taq 酶在加入反应混合物之前应保存在-20°C。在丙烯酸防护板后融化标记的引物。2. 每一个反应的混合物包括：灭菌 ddH20 6.95ul含 MgCl2的 10XPCR 缓冲液 1.25ul10mmol/LdNTP 0.25ul10mmol/L 未标记引物 0.5ul标记引物 0.5ul在优化实验条件过程中，如果 PCR 产物的放射信号强度太低，可以增加标记引物的用量，同时按相应比例调整 ddH20 的体积。TaqDNA 聚合酶（终浓度为 0.25U) 0.05ul对于一个 96 孔微孔板，准备用于 100 个反应的混合物。3. 混匀，按等份加入放置在冰上的 PCR 板中（9.5ul/样品）。4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng)，混匀。5. 把盖子盖紧，将板放入预热到 94°C 的 PCR 仪中。6. 如果产物大小是 200bp, 扩增 30 个循环。循环参数如下：94°C 初始变性 5 min;30个循环的 94°C 变性 30s; 根据经验确定的退火温度（Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通过引物序列计算出来，公式为 2(A+T)+4(G+C)。7. 扩增完成后，将样品于-20°C 冻存，或者直接进入方案 3。
内容来源：生物资料网，如果侵权麻烦联系网站工作人员删除！
