微生物是与人类关系密切的生物群体，有些对人类是有益的，有些则是严重的病原体。物种水平鉴定可以辨别同一属的两个物种，这在治疗传染病方面是很重要的。本文总结一些细菌、酵母或丝状真菌物种水平鉴定的传统和现代方法。
微生物鉴定的用途
医疗保健：准确、快速地鉴定细菌、真菌和寄生虫，以进行正确和及时的疾病诊断，并进行适当的治疗。
流行病学：为了追踪病原体和追踪疾病的传播和暴发，以及鉴定新的隔离物，例如抗生素耐药隔离。
制药工业：由于微生物是对无菌性的重大威胁，对环境微生物的准确鉴定通常是制药行业良好的生产实践(GMP)要求。
其他用途：包括刑事调查、微生物取证和环境研究等。
一、传统方法
传统的微生物鉴定方法依赖于表型鉴定，主要是用染色法、培养法和简单的生化检验。
- 宏观特征
宏观特征包括微生物的整体外观，其形状、大小、颜色和气味等，可以用肉眼看到。通过在琼脂培养基检查其形态学/宏观特征来确定微生物的类型。同一物种在不同的培养基中会出现不同的表现。
丝状真菌或霉菌似乎是“毛状”形状不规则的菌落，经常会产生可见的孢子，这些孢子可能看起来是粉状的或布满灰尘的。真菌菌落可以包含多种颜色，通常在中间有较深的颜色（中心通常凸起），从中心发射出较浅的颜色。丝状真菌从琼脂的中心呈放射性生长,最年轻的在外面，较老的深色物质(富含孢子)在里面。丝状真菌也可以呈单色绒毛状生长，没有明显的孢子迹象。
细菌通常形成不同的菌落，有时比真菌菌落更小，质地可以从粘滑到非常干燥，颜色可以从白色到鲜红色不等。细菌通常有强烈的气味，而丝状真菌则可以是无味的。酵母可能是最难根据宏观特征来鉴定的，其菌落通常看起来与细菌菌落相似，取决于物种和所使用琼脂的类型。
- 微观特性
通常通过染色使微生物在显微镜下更容易显示出来，最常用的几种染色方法如下：
a.革兰氏染色法
革兰氏染色通常是细菌鉴定的首选，基于结晶紫色染料。典型革兰氏阳性菌有芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌和梭状芽孢杆菌,而大肠杆菌、幽门螺杆菌和沙门氏菌则是革兰氏阴性。但有些细菌是革兰氏(染色)不定的，不适用于革兰氏染色法。
b.芽孢染色
这项技术涉及将染色剂应用于细菌样本，以检查孢子的存在。因为不是所有的细菌都能产生孢子，所以这些信息在鉴定中是有用的。孔雀石绿可能是最受欢迎的孢子染色剂。
c.抗酸染色
这是结核分枝杆菌(TB)染色的一个重要工具，它不能被革兰氏染色。首先使用石碳酸品红进行染色，然后再用一个复染剂，如亚甲基蓝。结核杆菌被染成红色，其他细菌则被染蓝。
d.真菌与酵母菌染色
真菌的染色通常是将真菌元素可视化，而不是区分真菌种类。真菌染色的例子包括:
乳酸酚棉蓝：是一种蓝色的染色剂，将真菌细胞壁中的碳水化合物染色
PAS染色法：将碳水化合物和其他部分染色，只在活的真菌中产生洋红色。这种方法在感染诊断中使用。
格罗克特乌洛托品银染色：将真菌细胞壁的颜色染成黑色，但不能区分活的或死的物质。
在植物/真菌共生和植物病理学的研究中，台盼蓝可以将真菌和植物结构染色。
3.简单的生化测试
a.过氧化氢酶试验
如果未知的细菌种类有过氧化氢酶的活性，当过氧化氢被添加到显微镜载玻片上的细菌时，就会出现气泡。葡萄球菌、微球菌、大肠杆菌和其他肠杆菌以及沙门氏菌是最常见的过氧化氢细菌，而链球菌和肠球菌则是过氧化氢酶阴性。
b.氧化酶试验
氧化酶试验鉴定细菌通过细胞色素c氧化酶(CCO)的活动，这种酶是细菌电子传递链的一部分。CCO将试剂(四甲基-对苯二胺)氧化为紫色的产物。当不存在酶时，试剂处于无色的还原状态。虽然氧化阳性细菌是需氧的，但它们不一定是严格的专性好氧菌，而且可能进行无氧呼吸。同样地，如果细菌物种具有一种不能与试验试剂反应的氧化酶，你将获得一个假阴性结果。
c.底物利用率测试
有许多用于微生物鉴定的底物利用率测试,这些测试(通常用于鉴定细菌物种)包含一组底物，比如不同的碳源和氮源。不同的细菌种类使用不同的底物，在细菌孵育后，记录底物颜色的变化，生成一种底物率利用模式，再与电脑生成的其他细菌物种的模式进行比较。这些测试与过氧化氢酶/氧化酶测试和显微镜观察相结合可能会更可靠，。
d.二叉式检索表
二叉式检索表包含一系列的步骤，其中每一步都描述了两种不同的特征，指导向下一步骤，直到鉴定完成使用此方法和上面列出的传统方法来帮助你鉴定目标有机体。
二、现代方法
传统的鉴定方法虽然仍被广泛使用，但存在两大缺点。它们只适用于可以体外培养的生物体，而且一些菌株表现出不符合已知种属模式的独特的生化特性。许多现代方法并不依赖于活的培养物，它们常常能揭示通过传统方法检测不到的有机体之间的细微差别。
1.PCR鉴定
PCR，包括实时荧光定量PCR，可能是最广泛应用于微生物鉴定的分子技术。利用PCR技术，可以快速检测和鉴定临床标本的微生物种类，从而加快诊断程序。大多数基于PCR的方法涉及一组通用的PCR引物，通过测序PCR扩增的序列来鉴定细菌/真菌样品。16S rRNA基因是PCR细菌鉴定的金标准序列，而内部转录间隔区(ITS)区域是真菌种类的主要条码标记。
2.微阵列芯片识别
基于微阵列的微生物鉴定依赖于预先扩增的微生物DNA序列与排列好的物种特异性的寡核苷酸探针的杂交。每一个探针含有一种不同的染料，在杂交过程中会发出荧光。 微阵列是一种多功能的工具，它能促进不同微生物样品的检测和鉴别。微阵列技术是一种快速的技术，在临床诊断和及时进行适当的抗菌治疗中，其速度是很重要的。基于基因芯片的平台通常使用和其他PCR为基础的方法类似的条码区域。
3.免疫学
基于ELISA的方法可以用于在单个物种基础上的微生物检测(通常是诊断学)。这些方法是高度敏感和特异性的，但依赖于特异性的抗体和目标生物体中高度差别的蛋白质。
4.化学分析
a.脂肪酸分析
脂肪酸在细菌细胞膜中是必不可少的，不同的细菌种类会产生不同的脂肪酸组合。因此，从一种未知的细菌种类中获得的脂肪酸可以被用来识别物种，通过与已知的脂肪酸特征相匹配。脂肪酸分析通常采用气相色谱分析和质谱法联用。
b.代谢指标
除了ATP，ADP等初级代谢产物是生长的必要条件，微生物还产生大量的次生代谢产物，它们对生长不是必要的，但可能在某些环境中是有利的，比如与其他微生物竞争营养。次生代谢产物包括抗生素、免疫抑制化合物、色素、抗氧化剂等，这些代谢物是现有和新兴药物的一个巨大来源。不同的物种通常会产生独特的次生代谢产物，这些使我们能够识别已知的微生物种类。代谢分析通常采用高效液相色谱和质谱分析法。
