酶联免疫斑点（ELISpot）是一种用于定量分析分泌分析物细胞数量的灵敏方法。细胞分泌的细胞因子、免疫球蛋白或其他目标蛋白在分泌后以及整个刺激过程中会被特异性抗体立即捕获。这种即时捕获使得ELISpot成为一种极为灵敏的夹心法检测，灵敏度可达单细胞水平。ELISpot检测原理：将细胞培养在包被有特异性捕获抗体的孔底部的膜表面，并在有或无刺激物的条件下进行培养。因此，细胞分泌的目标蛋白会被立即捕获。经过适当的孵育时间后，去除细胞，并使用检测抗体检测分泌的分析物。通过使用产生沉淀产物的底物，最终结果是在膜表面形成可见的斑点。每个斑点对应一个分泌蛋白的单个细胞的“足迹”。
ELISpot实验流程示意图
1. 用捕获抗体包被培养板
ELISpot培养板是一种塑料微孔板，其96个孔的底部都有一层聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，这与仅由塑料制成的ELISA培养板不同。PVDF膜提供了更大的膜表面积，从而增加了可以结合的捕获抗体的量；这一特性对于成功的ELISpot实验至关重要。
PVDF膜在高倍放大镜下类似海绵
1.1 ELISpot培养板（PVDF膜ELISpot板）
Mabtech可提供两种类型的ELISpot培养板：MSIP 和MAIPSWU
MSIP培养板底部附有塑料保护垫，有透明（货号3654-TP-10）和白色（货号3654-WP-10）两种形式可供选择。这两种颜色的板子在ELISpot读板仪中呈现略有不同的外观，但并不会影响实验结果。MSIP板的一个关键特征是它在左上角有一个“切角”。
MAIPSWU培养板，也被称为ELIIP，是白色形式的。它没有底部保护垫，但是底部有一个可拆卸的托盘。在洗涤步骤中，可以将培养板从托盘中取出。MAIPSWU培养板的一个关键特点是它在顶部和底部的右上角有两个“切角”。
1.2 乙醇预处理和培养板包被（*务必仔细操作）
就像一块干海绵一样，PVDF膜在能够吸收（结合）所需量的捕获抗体之前需要先被润湿。需要使用乙醇来达到这个目的，因为乙醇可以使膜变得亲水。此外，使用推荐浓度的捕获抗体（这可能会因分析物而异，但通常为15 ug/ml）可以优化斑点的外观。如果你将捕获抗体稀释到低于推荐浓度，你可能会得到模糊不清的斑点，这些斑点很难计数。
1.3 如何包被ELISpot板
1.21 向包被的所有孔中加入新配制的乙醇（用99.5%的原液在无菌水中稀释）。乙醇与膜接触后，膜会立刻变成淡灰色，这表明PVDF已经被激活。如果你打算包被多个培养板，一次只处理一个或两个培养板，以确保在乙醇的短暂孵育时间内完成操作。不要让乙醇停留时间过长！
-MSIP培养板——向每个孔中加入20 ul乙醇（35%）。乙醇在孔中停留时间不超过1分钟。
-MAIPSWU培养板——向每个孔中加入50 ul乙醇（70%）。乙醇在孔中停留时间不超过2分钟。
1.2.2 对于MAIPSWU培养板，倒空培养板，并用无菌水洗涤5次（每次200 ul/孔）。对于MSIP培养板，你可以先在孔中加入无菌水，而无需移除乙醇，然后用无菌水洗涤5次（每次200 ul/孔）。
1.2.3 倒空培养板。加入用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的包被抗体（100 ul/孔）。我们通常推荐包被抗体浓度为15 ug/ml（每孔1.5 ug抗体），但请查看具体产品的实验方案以获取详细信息。将包被有抗体溶液的培养板在4-8°C下放置过夜。
培养板处理tips: 在实验过程中，不要让培养板的膜变干。如果在乙醇预处理过程中培养板的膜变干了——不要惊慌，只需重复乙醇预处理步骤即可。小贴士！在洗涤步骤中，先将最后一次洗涤的液体留在孔中，然后准备好下一步所需的所有物品，再倒空培养板。
轻轻处理培养板，注意不要对培养板的底部施加压力。握住培养板的边缘，而不是顶部或底部，并且在倒空培养板时避免使用过大的力量。不要让移液器的枪头接触到膜，因为这可能会损坏膜并导致出现假象。
确保加入的溶液/试剂能够覆盖孔。在移液时也要避免产生气泡，因为气泡可能会阻碍试剂到达孔的底部。溶液覆盖不全或产生气泡可能会导致在显色后出现空白孔。
当需要在无菌环境中操作时，例如在层流罩中，使用多通道移液器来洗涤培养板。当不需要无菌条件时（请查看产品说明书），可以使用ELISA培养板自动洗板器，但要确保调整洗涤器喷头的位置，以适应ELISpot培养板较浅的孔。
2. 向培养板中加入细胞和刺激物
无论是自己包被培养板，还是使用Mabtech提供的预包被培养板，到这个阶段，ELISpot培养板已经准备好接受你的细胞（在添加200 ul与用于细胞培养的相同培养基以封闭培养板，并在室温下孵育30分钟之后——请遵循实验方案）。作为一种基于细胞的方法，细胞的活性对于成功的ELISpot实验至关重要。细胞在有或无激活刺激物（抗原或多克隆刺激剂）的条件下进行孵育，通常在适当的温度，一般是37℃。孵育时间应允许细胞最佳地分泌分析物，因此可以从几小时到几天不等。建议所有条件下都设置三份重复孔进行实验。
2.1 几乎所有细胞来源都可以使用——只要细胞是活的
ELISpot几乎可以应用于任何细胞来研究蛋白质分泌。目前已经有多种细胞的研究成果，包括人血液细胞、小鼠脾细胞、细胞培养物、黏膜组织细胞、异质细胞群、纯化的均质细胞以及细胞克隆。至少在人类样本中，最常用的细胞是外周血单个核细胞（PBMCs）。它们可以通过密度梯度离心（例如使用Ficoll）从血液中获得。得到的PBMCs可以直接使用，也可以冷冻保存以供日后使用。细胞冷冻和解冻的要求如下：
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冷冻 |
解冻 |
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标准冷冻程序包括使用含有DMSO和FCS的培养基。首先将装有细胞的小瓶放在-80°C的冷冻容器中过夜，然后转移到液氮或-150°C的冰箱中。 |
用培养基洗涤细胞两次（以去除DMSO）后，细胞应在37℃的新鲜培养基中静置1小时。这有助于去除细胞碎片，从而提高实验性能。 |
细胞质量对于获得可靠的结果至关重要。
使用活细胞比例高、凋亡细胞或死亡细胞比例低的样本，将使您获得成功的最大可能性。这不仅适用于ELISpot，而且适用于任何基于细胞的实验。如果您的样本中含有高比例的死亡细胞，您不能依赖最终结果，因为这些结果是基于反应细胞（斑点形成单位）与总细胞的比例得出的。
如果操作得当，冻存和解冻细胞并不是问题。但需要注意的是，外周血单个核细胞（PBMCs）应在采血后尽快制备。这是因为从采血后超过大约8小时的血液样本中制备的细胞可能会受到粒细胞的污染，从而干扰实验结果。如果必须在制备前储存血液样本（例如，如果您在下午晚些时候收到样本，需要过夜保存），则可以通过以下方法获得高质量的PBMCs：
- 轻轻搅动血液样本。
- 用PBS或RPMI将血液样本按1:1的比例稀释。
- 使用商业耗竭试剂盒从血液样本中耗竭粒细胞。
2.2 选择适合您细胞的培养基
培养基对细胞的健康至关重要。Mabtech推荐使用含有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基用于大多数细胞。在Mabtech，通常会在培养基中添加HEPES以维持细胞培养的pH值，并添加抗生素以降低污染的风险。由于RPMI 1640可能并非您实验的最佳培养基，您必须查阅相关资料，检查哪种培养基最适合您所研究的细胞。一般来说，我们推荐使用FCS作为血清来源。不同批次的血清在成分和功能上可能存在差异，因此在用于ELISpot之前，明智的做法是测试新的血清批次。所选用的血清应能够支持细胞培养并产生低背景染色，即不应引起细胞激活或蛋白质分泌。我们建议您不要使用同源血清（例如，用于人类样本的人类血清），因为它可能含有您打算检测的分析物和/或异嗜性抗体，这两者都可能引起背景噪声。如果在您的实验中不能使用胎牛血清（FCS），可以使用含有特定蛋白质的无血清培养基作为血清的替代品。在我们测试过的所有无血清培养基中，AIM-V最适合用于ELISpot实验。无论您选择哪种细胞培养基，至关重要的是在整个实验过程中，包括在添加细胞之前的封闭/调节步骤，都要使用相同的培养基。使用相同的培养基可以确保细胞在每个步骤中的环境保持一致，从而减少可能通过非特异性刺激影响最终结果的变量数量。
Mabtech内部使用的培养基：RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 100 ug/mL penicillin, 100 ug/mL streptomycin
2.3 选择合适的细胞数量
此时，培养板已经用捕获抗体包被，并在室温下用细胞培养基调节（封闭）至少1小时。在将细胞加入培养板之前，您需要对细胞进行计数，并将细胞浓度调整到所需的浓度。细胞计数可以通过自动细胞计数仪或使用显微镜进行台盼蓝染色来完成。由于只有活细胞才能分泌分析物，因此请确保在细胞计数中排除死亡细胞，并且如果可能的话，排除凋亡细胞。如果细胞浓度低于所需浓度，需要通过离心来浓缩细胞。
以下几点需要注意：
- 如果不确定合适的细胞数量，可以从每孔250,000个细胞开始。每孔的细胞数量必须根据细胞类型和预期的分泌细胞频率进行调整：预期的反应细胞频率越低，每孔所需的细胞数量就越高。如果预期频率是1/10,000个细胞，您将需要每孔大约250,000个细胞。相反，当频率较高时，例如1/100个细胞，每孔加入50,000个细胞就足够了。一般来说，抗原特异性反应需要更高的细胞数量（例如，每孔250,000个细胞），而多克隆/丝裂原阳性对照（例如，PHA，每孔50,000个细胞）则不需要那么多细胞。
- 细胞“喜欢”与其他细胞接触。在ELISpot中测量的斑点形成单位的数量并不总是与总细胞数量相关，因为需要一定数量的细胞才能实现适当的细胞间接触，从而实现最佳刺激。例如，在分析PBMC样本中的抗原特异性T细胞时，每孔的总细胞数量不应少于200,000个细胞。
- 避免涡旋。使用移液枪轻轻重悬细胞和沉淀物。
- 在将细胞加入ELISpot培养板之前，有时刺激细胞是有益的。对于需要较长时间才能开始分泌的分析物，可以在将细胞加入ELISpot培养板之前对细胞进行预刺激（最好在圆底聚丙烯管或培养板中进行，以增加细胞接触）。在某些情况下，这是一种良好的实践，例如，用R848 + IL-2刺激记忆B细胞72小时，以促进其分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。如果您选择预刺激，重要的是要注意，细胞在加入ELISpot培养板之前必须进行洗涤，以避免膜的背景染色。
2.4 接种并刺激细胞
当您选择了适合实验的细胞数量后，终于可以将细胞接种到培养板上并进行刺激了。除了您感兴趣的刺激物外，我们建议您同时设置三种对照：
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阳性对照 |
阴性对照 |
背景对照 |
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特异性抗原或多克隆抗体 |
不加刺激物 |
不加细胞，不加其他试剂 |
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说明试验是否有效，细胞是否有功能； 揭示假阴性结果 |
表示自发分泌的细胞数量； 揭示假阳性结果 |
指示试剂是否会产生假斑点（聚集）； 揭示假阳性结果 |
选择用于对照刺激的相关化合物在很大程度上取决于细胞类型和您实验的性质。刺激物可以是单克隆抗体（T细胞的抗CD3抗体）、肽段（CD8?T细胞的CEFRAS肽池，或CD4?T细胞的CEFTA肽池）、合成化合物（B细胞的R848+IL-2），或者是从细菌或植物中纯化的物质（T细胞的PHA）。在Mabtech看来，使用肽池或单克隆抗体进行抗原特异性刺激是更可取的，因为这些试剂的特性已经明确。
对于所有类型的刺激，抗原特异性或多克隆，Mabtech推荐以下两种技术：
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I. 先加刺激物，再加细胞 |
II. 将细胞和刺激物混合后再加入板 |
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采用这种方法时，刺激物和细胞将分别加入培养板中。当依次向每个孔中加入等体积的刺激物和细胞（各50微升）时，刺激物和细胞悬浮液应按最终实验浓度的2倍进行配制。细胞浓度为5×10?个细胞/毫升时，每孔将有250,000个细胞。至关重要的是要先加入刺激物，然后再加入细胞。在细胞接种后，不要再向孔中加入任何东西，因为这可能会将细胞推向孔的边缘，从而导致结果不理想。 |
在试管中将细胞和刺激物混合至最终实验浓度。每孔加入100微升；细胞浓度为2.5×10?个细胞/毫升时，每孔将有250,000个细胞。由于细胞会持续在试管中沉淀，记得要小心重悬细胞。 |
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如果您的样本只占据了培养板的一部分，那么请用培养基（每孔100ul）填满周围的孔，以减少在孵育过程中样本的水分蒸发。
将培养板放入培养箱: 在将细胞和刺激物加入培养板后，下一步就是将培养板放入培养箱中。一般来说，培养箱的温度应设置为37℃，二氧化碳浓度为5%。在孵育细胞时，需要注意以下两点：①用铝箔包裹培养板，尽管大多数培养箱能够维持最佳的湿度水平，但用铝箔包裹培养板是一种良好的实践，可以降低细胞培养基蒸发的风险。②将培养板并排放置，而不是堆叠放置。不要在培养箱中堆叠培养板。堆叠培养板可能会导致培养板之间出现不均匀的条件（例如，温度、二氧化碳浓度、蒸发率等），这可能会对细胞产生影响，进而影响斑点数量。
3. 让抗体捕获分析物
与ELISA不同，ELISpot在孔底使用特异性捕获抗体，在分泌后立即以及在整个刺激过程中捕获细胞因子、免疫球蛋白或其他目标蛋白。这就是ELISpot如此灵敏的原因。当培养板在培养箱中时，您现在只需等待抗体捕获分析物。需要注意的是：①不同分析物具有不同的动力学，在确定最佳细胞孵育时间时，要考虑蛋白质分泌的动力学。有些分析物，如颗粒酶B，在刺激超过48小时后才完全分泌，而另一些分析物，如干扰素γ，仅需12小时后即可进行分析。②在孵育期间不得移动培养板，避免在孵育期间移动培养板，因为这可能会对斑点形成产生负面影响。即使是微小的移动也应避免，因此要轻柔地关闭培养箱门。
4. 加入检测抗体
在孵育步骤之后，细胞已经响应刺激而分泌了分析物，而分析物已被包被在培养板上的特异性抗体捕获。现在是进行检测的时候了。这可能显而易见，但还是要说一下：在ELISpot实验中，您检测的是曾经存在并分泌您正在研究的分析物的细胞的“足迹”。因此，首先需要将细胞洗掉：倒空培养板，并用PBS（每孔200微升）洗板5次。ELISpot基于一种酶促检测系统。对于大多数试剂盒，检测步骤是使用生物素化的检测抗体，随后使用与酶结合的链霉亲和素来完成（“两步检测”）。然而，对于某些分析物，Mabtech提供了一种直接与酶结合的检测抗体（“一步检测”）。
两步检测: 检测抗体与生物素结合，生物素是一种对链霉亲和素具有高亲和力的小分子。加入这种生物素化的检测抗体是第一步。在第二步中，引入一种与检测抗体上的生物素分子强烈结合的链霉亲和素-酶结合物（见步骤5）。加入合适的底物完成斑点显色（见步骤6）。由于每个检测抗体上有多个生物素分子，而每个链霉亲和素-酶结合物又有多个生物素结合位点，因此信号被放大。
一步检测: 选择直接与酶结合的检测抗体可以减少实验步骤的数量。这节省了时间，但与两步检测系统相比，信号放大程度较低。然而，灵敏度的差异很小，而且重要的是，稍微低一点的灵敏度对于某些实验设置是有益的，因为它也可以降低背景信号。
5. 加入链霉亲和素-酶缀合物
一旦生物素化的检测抗体与分析物结合，就到了加入链霉亲和素-酶缀合物的时候了。需要注意的是，如果检测抗体是直接与酶结合的，您可以跳过这一步。
Mabtech使用的酶是碱性磷酸酶（ALP）或辣根过氧化物酶（HRP）。ALP和HRP催化不同的化学反应，因此需要不同的底物。Mabtech推荐使用BCIP/NBT-plus(货号3650-10)用于基于ALP的ELISpot，以及使用TMB(货号3651-10)用于基于HRP的ELISpot试剂盒（更多细节见步骤6）。一般来说，您可以选择使用ALP或HRP；这两种酶都适用于大多数应用。如果您是ELISpot领域的新人，Mabtech建议您选择ALP。这是因为HRP/TMB反应在某些实验设置中非常迅速，因此更难在最佳时间点停止反应。此外，BCIP/NBT-plus的斑点可以持久保留，而TMB的斑点则会随着时间的推移而褪色。
6. 加底物
在ELISpot实验中，底物需要能够形成沉淀，即在被酶催化后沉淀到孔底。这种沉淀形成了我们所说的“斑点”。市场上有很多种沉淀型底物，但Mabtech推荐使用BCIP/NBT-plus(货号3650-10)用于ALP，以及使用TMB(货号3651-10)用于HRP。这两种底物都具有很高的灵敏度，并且能够产生清晰、容易评估的斑点。
在ELISpot实验中，显色时间取决于分析物、检测抗体、酶结合物、所用底物以及分泌的分析物量等因素。如果您使用的不是Mabtech提供的试剂，可能需要对检测抗体和链霉亲和素-酶结合物进行梯度稀释实验，以找到最佳工作浓度。如果试剂由Mabtech提供，您可以直接按照试剂盒的说明书进行操作。一般来说，显色至阳性对照孔中的斑点清晰可见即可。显色时间因试剂和实验条件不同而有所差异，但通常以分钟计，而非小时。使用Mabtech的ELISpot Plus或ELISpot Pro试剂盒时，HRP-TMB反应（2-10分钟）比ALP-BCIP/NBT-plus反应（3-15分钟）更快。需要注意的是，过度显色可能导致背景变暗，降低斑点对比度。因此，通过预实验为每个项目、分析物和样本类型找到最佳显色时间是一个良好的实践。
终止反应的方法取决于您使用的是BCIP/NBT-plus还是TMB：
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酶+底物 |
显色时间 |
终止反应 |
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ALP+BCIP/NBT-plus |
3-15min |
自来水 |
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HRP+TMB |
2-10min |
去离子水 |
7. 斑点分析
在分析之前，培养板必须完全干燥。如果您不着急，可以将培养板放置一夜使其自然干燥。为了将干燥时间缩短到大约30分钟，Mabtech通常将培养板倒置放在层流罩中。如果您使用的是带有底部保护垫的MSIP培养板，在将其放入层流罩之前，请小心地拆卸底部的保护垫（例如，使用钳子）。
虽然可以用光学显微镜分析ELISpot培养板，但为了节省大量时间并减少错误，Mabtech建议您使用酶联免疫斑点读板仪。在分析培养板时，重要的是要认识到，尽管读板仪中有许多过程是自动化的，但您可以决定要计数哪些斑点。使用Mabtech Apex?软件（适用于ASTOR和IRIS），默认的计数设置适用于大多数情况。
然而，类似于流式细胞术中对细胞群体进行分选，您可以使用大小和强度的设置来确定您认为相关的斑点。由于ELISpot非常灵敏，因此在阴性对照孔中出现斑点并不罕见。这是正常的！Mabtech强烈建议您不要从“真实”斑点中减去这些斑点，而是使用一种统计分析方法，将阴性对照孔中的斑点纳入考虑，以判断您是否观察到阳性反应。
| 指标 | 货号 | 名称 |
| TNF-α | 3511-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse TNF-α (ALP) |
| 3511-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse TNF-α (HRP) | |
| IFN-γ | 3321-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) |
| 3321-4AST-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) | |
| 3321-4HPT-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| 3321-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| 3321-4APT-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) | |
| 3321-4HST-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| IL-1α | 3417-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1α (ALP) |
| 3417-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1α (HRP) | |
| IL-1β | 3317-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1β (ALP) |
| 3317-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1β (HRP) | |
| IL-2 | 3441-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-2 (ALP) |
| 3441-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-2 (HRP) | |
| IL-4 | 3311-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-4 (ALP) |
| 3311-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-4 (HRP) | |
| IL-5 | 3391-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-5 (ALP) |
| 3391-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-5 (HRP) | |
| IL-6 | 3361-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-6 (ALP) |
| 3361-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-6 (HRP) | |
| IL-10 | 3432-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-10 (ALP) |
| 3432-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-10 (HRP) | |
| IL-12/-23 p40 | 3451-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12/-23 p40 (ALP) |
| 3451-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12/-23 p40 (HRP) | |
| IL-12 p70 | 3456-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12 p70 (ALP) |
| 3456-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12 p70 (HRP) | |
| IL-17A | 3521-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-17A (ALP) |
| 3521-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-17A (HRP) | |
| IL-22 | 3376-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-22 (ALP) |
| 3376-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-22 (HRP) |
***以上为小鼠的elispot试剂盒，其他种属的elispot试剂盒详询艾美捷科技！
