Mabtech：ELISA操作指南

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗体的技术，用于检测和定量溶液中的目标分析物。这些目标通常是蛋白质，例如细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白、激素以及其他生物标志物。

ELISA的设置包括直接/间接（先抗原）、竞争性和夹心ELISA。在这里，我们重点关注夹心ELISA。它不仅因为通常具有低背景信号而成为我们的首选，还因为夹心ELISA通常通过匹配的抗体对增加了特异性。夹心ELISA包括捕获抗体和检测抗体，即所谓的抗体对，它们识别相同的目标分析物，但针对不同的表位。这种检测方法与三明治的形象类似，抗原被视为夹在两片面包之间的美味部分（就像奶酪或果酱），在ELISA中则是夹在两片抗体之间。这种生物分子三明治是检测的核心。为了定量反应，检测抗体要么直接标记，要么在检测中包含一个二级检测步骤。最后，加入一种可溶性底物，产生的颜色与结合的分析物量成正比。

夹心elisa流程示意图：

1. 包被捕获抗体：将捕获的抗体在PBS中稀释到推荐的工作浓度(Mabtech的ELISA Flex试剂盒的典型包被浓度为2 ug/ml)。每孔加100ul包被ELISA 96孔板(通常由聚苯乙烯制成，通过疏水结合来结合蛋白质)，在4-8℃下孵育过夜。(备注：如果您选择Mabtech的ELISA Pro试剂盒，则无需考虑包被步骤，因为板已预先包被)

2. 封闭：去掉板中的液体，每孔加入200 ul含有0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（孵育缓冲液）以封闭板，在室温下孵育1小时。备注：牛血清白蛋白（BSA）的封闭能力得到了充分证实，因此BSA作为一种蛋白封闭剂非常受欢迎。吐温20是一种非离子型封闭洗涤剂，但它属于易被水溶液洗脱的临时性封闭剂。因此，吐温被包含在封闭缓冲液中作为次要的封闭试剂。此外，如果将其添加到洗涤缓冲液中，吐温可以促进弱结合分子的解离，并在后续步骤中封闭新暴露的结合位点，从而进一步减少非特异性信号。

3. 洗板：用含0.05% Tween 20（每孔300 ul）的PBS洗涤5次。备注：洗涤步骤完成后，将板在吸水纸上轻拍以去除所有洗涤缓冲液。立即进行检测的下一步（不要让板晾干）。

4. 加标准品或者样本：每孔加入100 ul用孵育缓冲液或ELISA稀释液稀释的样本或标准品(设置背景对照，例如不含标准品的孔)，在室温下孵育2小时。按上述方法洗板。备注：所有样本至少应在所选的ELISA稀释缓冲液中稀释2倍。所有样本制备和标准品稀释均应使用相同的缓冲液。选择哪种缓冲液取决于样本类型。Mabtech推荐细胞培养上清用孵育缓冲液（含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS），血浆和血清样品用ELISA稀释液。如果您不知道样本应该如何稀释以获得在标准范围内的结果，Mabtech为您提供了一个ELISA样本稀释建议（下图）。这个建议涵盖了2倍、20倍和200倍的三种稀释范围。在选定的ELISA稀释缓冲液（孵育缓冲液或ELISA稀释液）中稀释样本。

5. 加入检测抗体：在孵育缓冲液或ELISA稀释液中稀释生物素化标记单抗至推荐工作浓度。每孔加入100 ul，室温孵育1小时。按照上面的方法洗板。备注：根据检测抗体的标记类型，分为一步法和两步法，一步法是抗体直接标记酶，两步法使用标记了生物素的检测抗体，在随后的步骤中，链霉亲和素会以极高的特异性与这些生物素分子结合。一般来说，两步检测被认为更灵敏，因为信号得到了放大。

6. 加入链霉亲和素-酶标记物：在孵育缓冲液中每孔加入稀释1:1000的链霉亲和素酶偶联物100ul。室温孵育1小时。按照上面的方法洗板。备注：在Mabtech，提供两种不同的链亲和素酶偶联物：链亲和素- HRP（SA-HRP）和链亲和素-ALP（SA-ALP）。与HRP反应相比，ALP反应更慢，但活性更呈线性。使用ALP时，您可以进行连续读数，以捕捉到最佳读数时间点，这在某些情况下可能很有帮助。与HRP不同，ALP不受叠氮化钠或其他抗菌剂的影响。但ALP可能会被半胱氨酸、氰化物、砷酸盐、无机磷酸盐以及螯合二价阳离子的化合物（如EDTA）抑制。

7. 加底物：每孔加入100 ul底物，包括空白孔。将板置于室温下，避光孵育。如果使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）：使用TMB底物（最好是冷的）,孵育15分钟。如果使用链霉亲和素-碱性磷酸酶（SA-ALP）：使用pNPP底物，孵育大约60分钟，在显色过程中可以在多个时间点读取板。

8. 加终止液：如果使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）+TMB：每孔加入100 ul 0.2 M H2SO4终止反应。备注：如果使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）+TMB，加入硫酸（H2SO4）将终止显色反应。通常的孵育时间是15分钟，如果观察到反应速度很快，可以将孵育时间缩短至5分钟。由于pH值变化剧烈，酶被失活，从而停止进一步催化显色反应。TMB最初呈蓝色，加入硫酸后会变成黄色。在这一步中，您不仅终止了反应，而且生成的衍生物更稳定，吸光度也更高。

9. 读板：如果使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）+TMB：在15分钟内使用ELISA读板仪在450 nm处测量吸光度，最好使用能够减去650 nm参考波长的读板仪。如果使用链霉亲和素-碱性磷酸酶（SA-ALP）+pNPP：在ELISA读板仪上于405 nm处测量吸光度。可以在之后进行多次读数，例如在30分钟、60分钟和90分钟时，最好使用能够减去650 nm参考波长的读板仪。

作为高品质ELISA试剂盒供应商，mabtech可提供三种版本的elisa试剂盒：