【前情回顾】ELISpot实验指南：从入门到精通
脾细胞（Splenocytes）至少在小鼠和大鼠样本中，是ELISpot和FluoroSpot实验中使用最广泛的细胞类型。脾细胞可以从脾脏中轻松分离，无需使用Ficoll分离。分离后的细胞可以直接使用，或者也可以选择将细胞冷冻保存，以便在后续时间点使用。
1. 脾细胞（Splenocytes）分离
取下小鼠或大鼠的脾脏后立即放入装有5ml培养基的无菌离心小瓶中。
自备材料：70um尼龙细胞筛，无菌；剪刀和镊子或钳子，无菌；培养皿，无菌
巴氏吸管，无菌；无菌注射器，3ml或5ml（不带针头）；聚丙烯离心管：15ml，无菌；培养基：含100ug/ml青霉素+100ug/ml链霉素的RPMI 1640
脾细胞分离步骤：
1. 将脾脏转入一个培养皿中。如果需要，使用剪刀和镊子或钳子去除多余的脂肪和组织。
2. 在一个新的培养皿中放置一个细胞筛，将脾脏转移到细胞筛中。加入5ml培养基。
3. 使用注射器的平头柱塞将脾脏通过细胞筛研磨到培养皿中。
4. 用5ml培养基冲洗细胞筛，将液体冲入培养皿。
5. 将脾细胞从培养皿转移到一个15ml的离心管中。
6. 让离心管静置一分钟，使大的细胞团沉淀，或者使用无菌的巴氏吸管去除细胞团和聚集物。将脾细胞悬浮液转移到一个新的15ml离心管中。用培养基将离心管加满。
7. 以300×g的速度离心10分钟。
8. 弃去上清液，用15ml培养基重新悬浮细胞沉淀。
9. 记录体积，并取少量样本进行细胞计数。
10. 以300×g的速度离心10分钟。 **提示！** 在这一步进行细胞计数。
11. 如果您想立即使用细胞：弃去上清液，通过轻轻上下吸打，用适量的细胞培养基重新悬浮细胞沉淀。脾细胞现在可以用于基于细胞的免疫分析，如ELISpot、FluoroSpot和流式细胞术。如果您想冷冻保存细胞，参考如下“脾细胞的冷冻保存”。
2. 脾细胞（Splenocytes）的冷冻保存
开始之前，标记冷冻管，并确保冷冻容器已准备好。将细胞在室温下长时间置于冷冻培养基中会影响细胞活性。
自备材料：冷冻培养基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 20%胎牛血清（FCS）和10%二甲基亚砜（DMSO）。如果您的细胞适应无血清培养基，请使用7% DMSO；
冷冻容器，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；聚丙烯离心管：50ml和/或15ml，无菌；自动移液器和无菌吸头；冷冻管，例如1.8ml;-80℃冰箱；-150℃冰箱或液氮罐。
脾细胞冷冻步骤：
1. 弃去上清液（来自第1部分的第11步），并将细胞用冷冻培养基稀释至每毫升500万到2500万细胞的浓度。如果您使用的是无血清冷冻培养基，则应将细胞浓度调整至每毫升100万细胞。
2. 将细胞分装至冷冻管中，例如每管1ml，并将冷冻管转移到冷冻容器中。确保通过持续重悬保持细胞处于悬浮状态。
3. 迅速将冷冻容器放入-80℃冰箱中，至少保存4小时，最多保存1周。
4. 将冷冻管从冷冻容器转移到-150℃冰箱或液氮罐中进行长期保存。
备注：对于1.8ml的冷冻管，每管分装1ml细胞悬浮液。对于其他尺寸的冷冻管，务必确保分装的体积小于最大容量，因为液体在冷冻过程中会膨胀。
3. 脾细胞（Splenocytes）解冻
开始之前，将水浴加热至37℃。提前将用于第2步的细胞培养基预热。在后续的洗涤步骤中使用的培养基保持室温即可。
自备材料：细胞培养基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、100 ug/mL青霉素+100 ug/mL链霉素；37℃水浴；聚丙烯离心管：50ml和/或15ml，无菌；吸管和移液器；动移液器和无菌吸头；室温离心机；37℃、5% CO2培养箱
脾细胞解冻步骤：
1. 迅速将细胞冻存管从冷冻保存处转移到37℃水浴中解冻细胞，直到仅剩小冰晶。 **提示！** 如果您打算解冻多个冷冻管，每次只取几个。冷冻培养基中含有DMSO，DMSO对细胞有毒，因此请尽快进行第2步。
2. 慢慢向冷冻管中加入0.5-1ml细胞培养基，重悬细胞，并将细胞从冷冻管转移到15ml管中。用1ml细胞培养基冲洗冷冻管，并将其转移到15ml管中。用细胞培养基将管子加满。
3. 以300×g的速度离心10分钟。
4. 弃去上清液，轻敲管子使沉淀变得不那么紧密。通过缓慢上下吸打，用1ml细胞培养基重悬细胞。加入细胞培养基，使总体积达到15ml。
5. 以300×g的速度离心10分钟。
6. 弃去上清液，用1ml细胞培养基重悬沉淀。
7. 将细胞放入CO2培养箱中放置1小时。将盖子稍微打开。**提示！** 利用这一个小时的空闲时间来清洗和封闭你的ELISpot/FluoroSpot板。
8. 孵育（细胞静置）后，重悬细胞并让任何聚集的细胞碎片沉淀（大约需要1分钟）。然后小心地将细胞悬浮液（不包括碎片）转移到一个新的15ml管中。
每个15ml管最多加入两个冷冻管的细胞（或大约3000万到4000万细胞）。
9. 计数细胞并确定细胞活性。可以使用自动细胞计数器或通过显微镜使用台盼蓝染色来进行细胞计数。因为只有活细胞才能分泌分析物，所以在细胞计数时务必排除死细胞，如果可能的话，还要排除凋亡细胞。如果细胞浓度低于所需浓度，再次离心细胞，重悬并稀释至正确的体积。
脾细胞制备好后，即可准备进行ELISpot实验。Mabtech作为ELISpot领域研究专家，可提供高品质小鼠和大鼠ELISpot试剂盒：
小鼠ELISpot试剂盒
| 指标 | 货号 | 名称 |
| IFN-γ | 3321-4APT-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) |
| 3321-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) | |
| 3321-4AST-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP) | |
| 3321-4HPT-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| 3321-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| 3321-4HST-2 | ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (HRP) | |
| IL-1α | 3417-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1α (ALP) |
| 3417-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1α (HRP) | |
| IL-1β | 3317-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1β (ALP) |
| 3317-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-1β (HRP) | |
| IL-2 | 3441-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-2 (ALP) |
| 3441-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-2 (HRP) | |
| IL-4 | 3311-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-4 (ALP) |
| 3311-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-4 (HRP) | |
| IL-5 | 3391-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-5 (ALP) |
| 3391-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-5 (HRP) | |
| IL-6 | 3361-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-6 (ALP) |
| 3361-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-6 (HRP) | |
| IL-10 | 3432-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-10 (ALP) |
| 3432-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-10 (HRP) | |
| IL-12/-23 p40 | 3451-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12/-23 p40 (ALP) |
| 3451-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12/-23 p40 (HRP) | |
| IL-12 p70 | 3456-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12 p70 (ALP) |
| 3456-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-12 p70 (HRP) | |
| IL-17A | 3521-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-17A (ALP) |
| 3521-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-17A (HRP) | |
| IL-22 | 3376-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-22 (ALP) |
| 3376-4HPW-2 | ELISpot Plus: Mouse IL-22 (HRP) | |
| TNF-α | 3511-4APW-2 | ELISpot Plus: Mouse TNF-α (ALP) |
| 3511-4HPW-2 | ELISpot Plus:Mouse TNF-α (HRP) |
大鼠ELISpot试剂盒
| 指标 | 货号 | 名称 |
| IFN-γ | 3221-4APW-2 | ELISpot Plus: Rat IFN-γ (ALP) |
| 3221-4HPW-2 | ELISpot Plus: Rat IFN-γ (HRP) | |
| IL-22 | 3275-4APW-2 | ELISpot Plus: Rat IL-22 (ALP) |
| 3275-4HPW-2 | ELISpot Plus: Rat IL-22 (HRP) |
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