原理
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。
材料与仪器
噬菌体 T4 DNA 连接酶 PCR 扩增的靶 DNA T 载体琼脂糖凝胶 水浴箱
步骤
一、材料1. 酶与缓冲液噬菌体 T4 DNA 连接酶2. 凝胶琼脂糖凝胶3. 核苷酸与寡核苷酸PCR 扩增的靶 DNA ( 25 μg/ml)4. 载体T 载体5. 特殊设备预设水温在 14℃ 的水浴箱二、方法1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液：25 μg/ml 扩增靶序列 DNA 1 μlT 质粒 20 ng10X 连接缓冲液 1 μl噬菌体 T4 DNA 连接酶 3 单位H2O 补足至 10 μl2. 将连接混合液在 14℃ 温育 4 h。3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布在含有合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。4. 计算实验组与对照组在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以直接用菌落 PCR 予以鉴定。5. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker分子量作对照）。6. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。
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