质粒快速鉴定
试剂：
Protoplasting buffer:
30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M
5mM EDTA 0.1ml/0.5M
50mM NaCl 0.1ml/5.0M
20% Sucrose 5ml/40%
50 µ g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml
50 µ g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml
补水至10ml，-20℃分装保存。
Lysis buffer:
89mM Tris-HCl, pH8.0
89mM boric acid 2ml of 5×TBE
2.5mM EDTA
2% SDS 2ml of 10%
5% sucrose 1.25ml of 40%
0.04% bromphenol blue 4mg
补水至 10ml ， - 20℃分装保存。
步骤：
1 ．将转化后的菌液铺平板， 37 ℃ 过夜培养。
2 ．配制 0 .6--0 .7% 的琼脂糖 TBE 胶。
3 ．用连续加样枪在 96 孔板中每孔加入 10 µ l Photo plasting Buffer 。
4 ．用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至含有 Photo plasting Buffer 的 96 孔板中，振荡混匀。
5 ．用连续加样枪将 Lysis Buffer 上样于凝胶中，每孔 4 µ l ，用排枪将细胞与 Protoplasting buffer 混合液 上样于凝胶中（细胞在 Protoplasting buffer 中不宜超过 30-40 min ），并点上 Marker 。
6 ．调节电压为 20V （小槽）或 40V （大槽），电泳 15min ，使细胞充分裂解，将电压调高到 200V ，继续电泳 1hr ，照相。
7 ．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
2．菌落PCR
1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。
2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中， 振荡混匀。
3．依次加入：
10xbuffer 2.5
Mgcl2 (25mM) 1.8
DNTP(2.5mM) 1
T3 引物（10pmol） 1
T7 引物（10pmol） 1
Taq酶 0.4
total 25ul
各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上
4．94℃，2min。
5． 94℃ 4分钟
94℃ 40秒
53.6℃ 40秒 35个循环
72℃ 4分钟
72℃ 10分钟
4℃ 24小时
6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图， 根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。
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