金黄色葡萄球菌基因敲除服务简介
我们的金黄色葡萄球菌基因敲除载体系统是基于pKOR1载体而构建的，它是一个可以在革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌中都可以启动质粒复制的载体，同时也是金黄色葡萄球菌同源重组载体温度敏感型自杀质粒。repF复制子pLE194Ts是温度敏感性复制子，在30℃以下可以复制，在42℃以上温度无法复制，所以通过温度筛选的方法获得基因缺失株；另外该复制子中还包含一段金黄色葡萄球菌重组酶基因，该基因有利有同源交换的进行。
优势
1.温度敏感型自杀质粒pKOR1可做到无痕敲除。
2.可提供修饰外源质粒的金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌RN4220是从NCTC8325的突变体中筛选得到的突变株，可以相对较高效地转化大肠杆菌来源的DNA质粒。
3.丰富的金黄色葡萄球菌基因敲除经验：可根据客户需求选择合适的载体，为客户进行敲除条件的摸索及优化。
4.一站式服务：引物设计及优化、基因敲除质粒构建，敲除菌株筛选及后续处理、数据及报告整理。
实验方案
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服务名称
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服务内容
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服务周期
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价格
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敲除体系选择
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敲除载体：pKOR1
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敲除载体构建
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抗性基因选择，引物设计合成，敲除片段融合，敲除片段与载体连接，单克隆筛选鉴定与测序验证
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6-8周
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敲除与敲除株筛选
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转化RN4220、抗性平板筛选、转M28A，温度筛选、抗性筛选、PCR鉴定
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10-12周
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实验菌株：
金黄色葡萄球菌M28A：
敲除株，BHI培养基培养，经药物敏感性预实验结果，选用红霉素抗性基因来敲除目的基因。
金黄色葡萄球菌RN4220：
ccdB Survival DB3.1：感受态。
实验质粒：
pKOR1：
金黄色葡萄球菌同源重组载体温度敏感型自杀质粒。
pMG36e：
扩增红霉素抗性基因。
实验准备：
提取M28A基因组、pKOR1和pMG36e质粒，备用。
实验方案/步骤：
一、构建pKOR1敲除载体
1、扩增terL基因的5’和3’侧翼序列及红霉素抗性基因
50 µL反应体系：
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试剂
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体积(µL)
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2×phanta Max Master MIX
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25
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terL-5'-F0/terL-3'-F/erm-F
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2
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terL-5'-R/terL-3'-R0/erm-R
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2
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dd H2O
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19
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M28A/pMG36e
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2
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反应程序：
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步骤
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温度
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时间
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循环
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预变性
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95℃
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3min
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-
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变性
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95℃
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15 S
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35×
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退火
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55℃/58℃/45℃
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15 S
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延伸
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72℃
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1min15S/1min/1min
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终延伸
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72℃
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5 min
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-
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1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收产物，测定产物浓度，备用。
2、融合PCR扩增TerL的5’-erm-TerL的3’片段
50 µL反应体系：
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试剂
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体积(µL)
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2×phanta Max Master MIX
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25
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terL-5'-F0
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2
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terL-3'-R0
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2
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dd H2O
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18
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5’侧翼序列
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1
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3’侧翼序列
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1
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erm基因片段
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1
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反应程序：
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步骤
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温度
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时间
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循环
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预变性
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95℃
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3min
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-
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变性
|
95℃
|
15 S
|
35×
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退火
|
58℃
|
15 S
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|
延伸
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72℃
|
3min
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终延伸
|
72℃
|
5 min
|
-
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1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收产物，测定产物浓度，备用。
3、PCR扩增构建载体的敲除盒片段
50 µL反应体系：
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试剂
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体积(µL)
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|
2×phanta Max Master MIX
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25
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P-terL-5'-F
|
2
|
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P-terL-5'-R
|
2
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dd H2O
|
19
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5’-erm-3’片段
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2
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反应程序：
|
步骤
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温度
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时间
|
循环
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预变性
|
95℃
|
3min
|
-
|
|
变性
|
95℃
|
15 S
|
35×
|
|
退火
|
55℃
|
15 S
|
|
延伸
|
72℃
|
2min15 S
|
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终延伸
|
72℃
|
5 min
|
-
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1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收产物，测定产物浓度，备用。
4、酶切质粒
将载体进行双酶切（KpnI、SacI），体系如下：
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10X QuickCut Buffer
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5 μL
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质粒DNA
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≤2 μg
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QuickCutKpnI和SacI
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1 μL和1 μL
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灭菌水
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Up to 50 μL
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轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温60min；回收产物测定浓度。
5、连接
碧云天同源重组试剂盒载体构建
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插入片段
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比例
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插入片段与载体的摩尔比
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3：1
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纯化的PCR片段
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10-100ng
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线性化载体
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50-100ng
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2×Seamless CloningMix
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10μL
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无酶水
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？
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总体积
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20μL
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上述反应体系置于50℃孵育15min。
6、热激转化ccdB Survival DB3.1
（1）吸取100μL感受态细胞液至小离心管中，加入质粒DNA。(DNA不超过10μL,小于50ng)轻旋混合，置于冰上30min；
（2）42°C循环水浴，静止放置90s；
（3）快速转移到冰浴，冷却2~5min；
（4）每管加800µL LB培养基,短暂回温后，置于37°C, 180rpm摇床培育45min；
（5）吸取适量转化后感受态细胞,涂板于含有300µg/mL氨苄抗性的LB琼脂平板上；
（6）将平板置于37°C恒温暗培养箱中,先正面培养30min,随后倒置培养。(隔夜，15h左右可见菌落)。
（7）挑取若干菌落于2mL含300µg/mL氨苄抗性的LB肉汤中培养，菌液进行PCR鉴定。
7、PCR鉴定与测序验证
20 µL反应体系：
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试剂
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体积(µL)
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2×phanta Max Master MIX
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10
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seq-Fj
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1
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seq-Rj
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1
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dd H2O
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7
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菌液
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1
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反应程序：
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步骤
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温度
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时间
|
循环
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预变性
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95℃
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3min
|
-
|
|
变性
|
95℃
|
15 S
|
35×
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退火
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57℃
|
15 S
|
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延伸
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72℃
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2min
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终延伸
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72℃
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5 min
|
-
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1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性菌落送测序验证。测序结果与模板序列一致，则敲除载体构建成功，进行下一阶段实验。
二、电转化RN4220修饰敲除载体
1、提取DB3.1中的敲除质粒；
2、制备RN4220感受态：
① 挑取单菌落于B2肉汤中在37℃过夜培养；
② 以1/25的比例转接到新鲜的25mL B2肉汤中(300mL培养瓶)，37℃振荡培养至对数生长期；
③ 离心收集菌体；
④ 等体积的去离子水洗涤3次；
⑤ 用1/5和1/10体积的10%甘油洗涤2次；
⑥ 1/10体积的10%甘油中孵育15min；
⑦ 离心后，800µL的10%甘油重悬；
⑧ 分装70µL/份，-80℃冰箱中保存待用。
所有洗涤液和孵育条件均为20°C，所有离心均为800rpm、10 min。
3、在参数为25 μF，2.5 kV，200 Ω的电转条件下，将0.5 μg敲除质粒电转入RN4220感受态；
4、含25μg/mL氯霉素的BHIA筛选。
三、敲除载体电转化M28A和初筛敲除株
1、提取RN4220中的敲除质粒；
2、制备M28A感受态，方法同上；
3、在参数为25 μF，2.5 kV，200 Ω的电转条件下，将敲除质粒电转入M28A感受态细菌中，并涂板于氯霉素抗性的BHI平板上；
4、挑取平板上长出的单菌落过夜培养后1:100接种于5 mL不含抗生素的BHI培养基中；
5、42℃振荡培养24 h后，再将培养产物1:100接种于5 mL不含抗生素的BHI培养基中，25℃振荡培养24 h；
6、重复上述步骤2次后将培养产物三线法划线于不含抗生素的BHI平板，置37℃恒温培养箱培养24 h；
7、挑取单菌落分别接种至含50μg/mL红霉素的BHI平板和含25μg/mL氯霉素的BHI平板，置37℃恒温培养箱培养24 h；
8、其中在红霉素平板上生长，而在氯霉素平板上不生长的菌落为初筛重组成功的terL基因敲除株。
四、敲除株的鉴定
分别以初筛重组成功的terL基因敲除株染色体基因组DNA和M28A染色体基因组DNA为模板进行多重PCR鉴定。
所用引物如下表：
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引物编号
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引物名称
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片段大小
|
退火温度
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备注
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①
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terL-F
|
552bp
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58℃
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terL基因鉴定
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terL-R
|
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②
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terL-5'-Fj
|
622bp
|
56℃
|
terL的5’-erm鉴定
|
|
erm-Rj
|
|
③
|
erm-Fj
|
806bp
|
56℃
|
terL的erm-3’鉴定
|
|
terL-3'-Rj
|
|
④
|
terL-5'-Fj
|
1405bp
|
56℃
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敲除盒片段鉴定
|
|
terL-3'-Rj
|
若初筛敲除株的鉴定结果：①为阴性，②、③、④为阳性，则证明敲除成功。
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