检测营养不良基因缺失的诊断性多重 PCR 实验

材料与仪器

反应混合物A、B 和 CTaq DNA 聚合酶 DNA 模板 石蜡油 溴化乙锭的微型琼脂糖胶 电泳缓冲液 10 X 胶用载样缓冲液微量吸管 热循环仪 微量吸管

步骤

1. 在冰上融化这三种反应混合物（ A 、 B 和 C )，根据需要扩增的检测样本数（ 每50卩1 的反应体系需要44. 5jul的反应混合物）来计算每种混合物的量。计算足够量的另外 用于平行阳性（ 来自男性完整的营养不良基因）和 阴 性 （ 未加模板）对照的反应物 2. 5jul，以及另外0. 5^1补偿取样时样品的丢失量。 2. 分装适量的各种混合物至标有A 、 B 和 C 的 1.5m l 微量离心管中，冰上操作。加 〇.5^1每反应体系5U / 4 的 D N A 聚合酶至离心管中。用移液管充分混勻，离心 5〜10s，将管壁上的液体离心至管底。 3. 将要进行循环的反应管在相应的管盖上标记。将管子放于冰上，每管分装45^1准备 好的反应混合物。 4 . 每管加人5 4 SOng/jul的 D N A 模板。最后阴性对照管中加人5 M 无菌水。5.如果所使用的循环仪没有热盖，每 管 中 加 入 一 滴 （25〜 5〇 4)石 蜡 油 ，然后盖 紧盖子。滴石蜡油时避免管内的液体飞溅到其他管子中。高 速 离 心 5 〜10s，将 所有液态的反应成分离心至石蜡油层的下面，确保石蜡油完全覆盖反应混合物 的表面。 6.预热一部循环仪至94°C ，放上含有反应混合物A 的管子，依照下列条件扩增。 起始步： 6min 94〇C (变性） 2 5 个循环： 3.0s 94〇C (变性） 30s 53〇C (退火） 4min 65〇C (延伸） 最后~^步： 7min 65〇C (延伸） 检测前于4°C 保存。 预热另一部循环仪至94°C ， 依照以下条件扩増所有混合反应物B 和 C 。 起始步： 6min 94〇C (变性） 2 5 个循环： 30s 94〇C (变性） 4min 65°C (延伸和变性) 最后~^步： 7min 65〇C (延伸） 检测前于4°C 保存。 8. 准备1.5%、含 0.5jug/m l 溴化乙锭的琼脂糖微型胶（ 胶的体积为25ml)，以及同样 浓度的溴化乙锭电泳缓冲液。 9. 在同面胶上电泳每对引物的所有产物，便于直接将阳性和阴性对照与患者的样本进 行比较。在胶上点样前，首先在一张石蜡膜上点上2^1大小的I O X 载样缓冲液（ 一 面胶的载样缓冲液要足量，以防点样时蒸发） 。将移液管tip插入油层下面的液态反 应产物中，吸取154 P C R 产物， tip在经过油层时要将空气中的气泡排掉。用纸擦 掉 tip上多余的石蜡油，将反应产物与载样缓冲液在石蜡膜上混合。 10. 以2V /c m 将微型胶电泳15min，然后5V /c m 电泳9〇 min，直到溴酚蓝与胶底边相 差 lcm。照相，记录结果。照相时要仔细检查每面胶，确保所有条带能准确地照 下来。 11. 于 4°C 保存剩余的产物，直到胶图照相完成和结果得到解释为止。如果胶检测出现 了问题，在扩增几星期后还可再将样品进行电泳检测。 12•记录，并且根据图9.1.3示范的标准形式解释P C R 结果。备用方案为检测出剂量差别而使用的放射性标记低循环数多 重 PCR 接下来的方案通过放射性标记解决了与男性带有重复的营养不良基因和女性缺失型 携带者相关的问题。 附加材料 10mCi/ml [cr32P] dCTP (3000mCi/mmol) 低于2 % 的琼脂糖胶： pourhot (80°C )，必要时预热模式 Centricon 100 浓 缩 器 （ Amicon) 带有固定角度转子（23°〜45°)的离心机：如 Bechman JA-18.1 Whatman 3MM 滤纸 光密度计或PhosphorImager 1. 精确地设计一个PCR反 应 体 系 （ 基本方案，第 1〜5 步） ，另外在第2 步的每管反应 体系中加5 ^ 1 [cr32P] dCTP (lOmCi/mlO.50)。在循环仪上扩增18个 循 环 （ 基本 方案，第 6 步） 。 2.供选择：根据操作守则在一个Centricon 100浓缩器的桶中收集2m l 水，从石蜡油下 面取出液态的P C R 产物，并稀释至水中。以 IOOOg•的转速在一个固定角度转子上离 心 30min，去掉未结合的核苷酸。加 入 2m l 水重新悬浮样品，再次离心。倒置浓缩 器，将浓缩的物质离人retentate cup中。 3. 分离出1/4纯化的PCR产 物 （ 常 规为lOjul，根据装Centricon管子的转子的角度而 定） ，置于中或大号琼脂糖胶上，胶的浓度要一致且小于2 % 。 4•用水简单地清洗一下，将胶表面的放射性物质洗掉。用几片Whatman 3M M 滤纸将 水滴吸干。 5. 将胶放在预热胶干燥器上的一张Whatman 3 M M 滤纸上，并用一张塑料膜盖 住 。 80°C ，将胶干燥30min〜lh。 6. 放射自显影照片2〜24h 。通过在不同的曝光时间照相，确保有一张照片在线性范围 内，用光密度计分析相关的条带的强度，与正常对照进行比较。另外，也可以使用 PhosphorImager 0 支 持 方 案 诊 断 用 PCR混合物的制备和保存 如果引物的质量好，一般不需要特殊的纯化；然而，为了确保扩增的最大效率和产 量，用聚丙烯酰胺胶（ C P M B 单 元 2. 1 2 ) 纯化值得推荐。因为各种引物在一起会增加 盐类物质的污染，如果引物纯化涉及最后的乙醇沉淀步骤，要特别注意尽可能地洗掉盐 类物质。检测男性重复和女性杂合缺失是特别敏感的，为求准确可能要求纯化引物。 材 料 （ 标V 条目参见附录1) 寡核苷酸P C R 引 物 （ 表 9.1.1、表 9.1. 2、表 9.1. 3 和表9.1. 4) 无菌双蒸水V P C R 缓冲液：含 15mmol/L MgCl2 的 1〇 X P C R 扩增缓冲液 V 2. 5 mmol/L 4dNTP 混合物 1.用无菌双蒸水稀释引物至400叩/^1。将未使用的引物置于1.5m l 的微量离心管，盖 紧，储存在一20°C 。分装出一些引物去保存，在特别使用时用来混合其他新的化合 物。对于每一对引物，在单独或与少数的其他引物联合使用时， 50W 的 P C R 反应体 系中每对引物使用0.5|ul (假设每对引物26个碱基，最终浓度为0.5^m 〇 l/L )。 2.在 I .5ml微量离心管上标记“pri-A” 、 “pri -B ” 和 “pri-C ”， 为这三个诊断实验配置 引 物 混 合 物 （ 假 设 在 50jul反应体系中每对引物加1.04)，在管中加人如表9. 1.1所 示的等量引物，表 9.1. l(“pri-A ”） 、 表 9. I.2(“pri-B”）和表 9. I.3(“pri-C ，，） 。 3 . 在 I .5ml微量离心管中，准备主要的最终反应体系，如下所示每组2 5 反应/管 。 混 合 物 A 混 合 物 B 混 合 物 C 成分 637. 5^1 125jul IOOtJil 250卩 I (pri-A ) 662. 5|ul 125^1 IOOixl 250jnl (pri-B) 712. 5^1 125^1 l 〇 〇 lxl 250^x1 (pri-C ) 无菌双蒸水 P C R 缓冲液 2. 5mmol/L 4dNTP 混合物 混合引物 同时准备多重反应混合物，在一20°C密 封 保 存 （ 如 用 Parafilm)，< 3 个 月 ，或 者在一70°C长期保存。根据实验待处理的数量进行调整，使各组能被整除，但反复 冻融不要超过三次。

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