摘要
猴γ干扰素（IFN-γ）是评估非人灵长类动物（NHP）细胞免疫应答的关键标志物。本文介绍一种基于ELISpot Plus技术的猴IFN-γ（HRP）检测方法，通过双抗体夹心法特异性识别分泌IFN-γ的细胞，适用于疫苗开发、感染性疾病及免疫调节研究。文章涵盖检测原理、实验流程、数据分析及典型应用案例，并附关键实验图示。
1. 引言
IFN-γ由活化的T细胞和NK细胞分泌，在抗病毒、抗肿瘤免疫中发挥核心作用。非人灵长类动物（如猕猴）因其与人类免疫系统的相似性，成为研究HIV、结核等疾病的重要模型。传统ELISA技术可定量IFN-γ浓度，但无法定位分泌细胞；ELISpot技术通过捕获局部释放的细胞因子，实现单细胞水平的功能分析，灵敏度高达1/100,000细胞1215。
2. 试剂盒原理与性能
2.1 检测原理
ELISpot Plus试剂盒采用双抗体夹心法：
- 预包被抗体：微孔板预先固定抗猴IFN-γ捕获抗体；
- 细胞培养与刺激：加入待测细胞及抗原刺激物（如肽库），分泌的IFN-γ被捕获；
- 检测抗体：生物素化抗IFN-γ二抗与目标结合；
- 信号放大：链霉亲和素-HRP偶联物催化底物显色，形成可见斑点（每斑点代表一个分泌细胞）1215。
2.2 关键性能参数
- 特异性：匹配单克隆抗体对，特异性识别NHP IFN-γ，与人IFN-γ交叉反应性低；
- 灵敏度：可检测低至50个分泌细胞/孔；
- 稳定性：试剂盒保质期18个月，板条可室温保存，抗体需4-8℃存储；
- 应用范围：适用于疫苗效力评估（如HIV DNA疫苗）、感染模型免疫监测等。
3. 实验方法与优化
3.1 样本制备
- 外周血单核细胞（PBMC）：密度梯度离心法分离，调整至1×10^6 cells/mL；
- 刺激条件：使用特异性抗原（如SIV肽库）或促分裂原（如PHA）活化细胞，37℃、5% CO2培养16-24小时。
3.2 操作流程
- 板条预处理：平衡至室温，避免冷凝水影响；
- 细胞接种：加入100 μL细胞悬液/孔，设置阴性对照（培养基）及阳性对照（PHA刺激）；
- 孵育与洗涤：37℃孵育后，PBS-Tween彻底洗涤去除细胞；
- 检测与显色：依次加入生物素化抗体、HRP偶联物及TMB底物，避光显色；
- 斑点计数：使用自动ELISpot读数仪分析斑点数量与大小。
3.3 常见问题与优化
- 背景过高：减少细胞密度或缩短刺激时间；
- 斑点模糊：优化洗涤次数（建议5次），确保去除非结合抗体；
- 阴性对照显色：检查试剂污染或细胞自发活化。
4. 应用案例
4.1 HIV疫苗免疫原性评价
研究显示，DNA疫苗诱导的HIV Gag特异性T细胞在猕猴模型中可产生长效IFN-γ应答，ELISpot检测证实加强免疫后斑点数量显著增加。
4.2 SIV感染模型中的免疫调控
通过ELISpot分析SIV特异性滤泡CD8+ T细胞，揭示其与滤泡辅助T细胞的协同作用，为病毒载量控制机制提供依据。
5. 数据分析与标准化
5.1 斑点计数标准
- 有效斑点：直径>50 μm，边缘清晰；
- 背景扣除：阴性对照斑点数>10%实验组时需重新验证；
- 数据表达：以斑点形成细胞（SFC）/10^6 cells表示。
5.2 多中心实验一致性
采用统一刺激协议与数据分析软件（如AID ELISpot Reader），可使实验室间CV<15%，满足疫苗临床试验要求。
结论
ELISpot Plus猴IFN-γ（HRP）试剂盒为NHP免疫研究提供了高灵敏度、高特异性的技术平台。结合标准化操作与自动化分析，可广泛应用于基础研究及转化医学领域，尤其为疫苗开发与感染免疫机制解析提供关键数据支持。
