恭喜你！点开这篇推文，你的免疫组化实验已经成功了一半！
下面让我们一起来了解下今天讨论的主题：免疫组化
一、免疫组化常用的染色方式
HE染色
苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining ) ，简称HE染色法，是石蜡切片技术种常用的染色法之一。主要染色原理为苏木精染液为碱性，可使细胞核内的染色质与胞质内的核酸呈蓝色；伊红为酸性染料，可使细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
DAB染色
与HE染色不同的是，DAB染色能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞中蛋白的表达情况。主要是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。
虽然看起来实验原理很简单，但是理想很丰满，现实很骨感。。。
实验结果出来后总是恨自己眼高手低
开始思考是哪位神仙给的自信，竟敢让自己拥有一次实验就成功的猖狂幻想！
实验小贴士
为了保证实验结果的准确性和可靠性，请在实验开始前检查您的实验设计是否符合以下要求
1.每组实验设置有阴性对照和阳性对照
2．确定目标抗原是否仅在特定部位表达
OK现在开始进行小伙伴们的日常实（典）验（型）结（案）果（例）展览
真的是该出的状况应有尽有
二、常见实验问题
1. 片子均为阴性结果，包括阳性对照。
2.片子均为阳性结果，包括阴性对照。
3.片子背景高。
4.阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性结果。
三、原因分析及建议:
片子呈阳性结果
1.切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。
建议降低抗体浓度，保持片子的湿润，首次实验设置抗体浓度梯度，选择最佳条件。
2.缓冲液配置中未加氯化钠和pH值不准确，洗涤不彻底。
建议检查缓冲液pH,充分洗涤。
3.使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
建议更换新的呈色底物。
4.抗体温育的时间过长。
建议适当缩短抗体孵育时间。
5.H2O2浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。
建议降低H2O2浓度，控制呈色速度，及时清洗。
切子片背景过深
1.内源性过氧化酶没有完全阻断。
建议使用H2O2对样本进行预处理。
2．切片或涂片过厚。
建议调整切片或涂片厚度。
3．漂洗不够。
建议充分漂洗，可以每次短时间漂洗，重复漂洗几次。
4．底物呈色反应过久。
建议时刻观察呈色效果，及时终止反应。
5．蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
建议使用二抗同种属来源的血清进行样本封闭，可适当延长封闭时间。对于免疫多标，可以选择经过血清预吸附处理的二抗减少背景非特异性结合。
6．使用全血清抗体稀释不够。
建议首次实验设置浓度梯度，选择最佳条件。
片子染色不均一
1.脱蜡不充分。
建议60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。
2.水化不全。
建议应经常配制新鲜的梯度乙醇。
3.抗体没混匀。
建议用移液枪充分混匀一抗/二抗等试剂。
4.抗体孵育时，切片放倾斜。
建议保持片子水平，均匀孵育。
5.抗体孵育后PBS冲洗不充分。
建议建议充分漂洗，可以每次短时间漂洗，重复漂洗几次。
6.制片厚薄不均匀等问题。
建议统一设置切片厚度。
7.染片盒不平，切片倾斜。
建议建议保持片子水平，均匀孵育。
阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应
1.标本固定和处理不当。
建议重新制备样本。
看过以上的原因分析及建议，是否对免疫组化实验有了更清晰的优化方向了呢？快快行动起来开始新的免疫组化实验吧！
恭喜你！点开这篇推文，你的免疫组化实验已经成功了一半！
下面让我们一起来了解下今天讨论的主题：免疫组化
一、免疫组化常用的染色方式
HE染色
苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining ) ，简称HE染色法，是石蜡切片技术种常用的染色法之一。主要染色原理为苏木精染液为碱性，可使细胞核内的染色质与胞质内的核酸呈蓝色；伊红为酸性染料，可使细胞质和细胞外基质中的成分呈红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
DAB染色
与HE染色不同的是，DAB染色能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞中蛋白的表达情况。主要是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。
虽然看起来实验原理很简单，但是理想很丰满，现实很骨感。。。
实验结果出来后总是恨自己眼高手低
开始思考是哪位神仙给的自信，竟敢让自己拥有一次实验就成功的猖狂幻想！
实验小贴士
为了保证实验结果的准确性和可靠性，请在实验开始前检查您的实验设计是否符合以下要求
1.每组实验设置有阴性对照和阳性对照
2．确定目标抗原是否仅在特定部位表达
OK现在开始进行小伙伴们的日常实（典）验（型）结（案）果（例）展览
真的是该出的状况应有尽有
二、常见实验问题
1. 片子均为阴性结果，包括阳性对照。
2.片子均为阳性结果，包括阴性对照。
3.片子背景高。
4.阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性结果。
三、原因分析及建议:
片子呈阳性结果
1.切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。
建议降低抗体浓度，保持片子的湿润，首次实验设置抗体浓度梯度，选择最佳条件。
2.缓冲液配置中未加氯化钠和pH值不准确，洗涤不彻底。
建议检查缓冲液pH,充分洗涤。
3.使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
建议更换新的呈色底物。
4.抗体温育的时间过长。
建议适当缩短抗体孵育时间。
5.H2O2浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。
建议降低H2O2浓度，控制呈色速度，及时清洗。
切子片背景过深
1.内源性过氧化酶没有完全阻断。
建议使用H2O2对样本进行预处理。
2．切片或涂片过厚。
建议调整切片或涂片厚度。
3．漂洗不够。
建议充分漂洗，可以每次短时间漂洗，重复漂洗几次。
4．底物呈色反应过久。
建议时刻观察呈色效果，及时终止反应。
5．蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
建议使用二抗同种属来源的血清进行样本封闭，可适当延长封闭时间。对于免疫多标，可以选择经过血清预吸附处理的二抗减少背景非特异性结合。
6．使用全血清抗体稀释不够。
建议首次实验设置浓度梯度，选择最佳条件。
片子染色不均一
1.脱蜡不充分。
建议60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。
2.水化不全。
建议应经常配制新鲜的梯度乙醇。
3.抗体没混匀。
建议用移液枪充分混匀一抗/二抗等试剂。
4.抗体孵育时，切片放倾斜。
建议保持片子水平，均匀孵育。
5.抗体孵育后PBS冲洗不充分。
建议建议充分漂洗，可以每次短时间漂洗，重复漂洗几次。
6.制片厚薄不均匀等问题。
建议统一设置切片厚度。
7.染片盒不平，切片倾斜。
建议建议保持片子水平，均匀孵育。
阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应
1.标本固定和处理不当。
建议重新制备样本。
看过以上的原因分析及建议，是否对免疫组化实验有了更清晰的优化方向了呢？快快行动起来开始新的免疫组化实验吧！
