Gateway 克隆（LR 反应）

简介

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统，是利用载体上一系列特殊的酶，可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起，将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

原理

Gateway 克隆原理基于不同酶的催化反应，能够快速、准确地完成 DNA 序列的切割、转录和接合。其中 LR 反应发生在入门载体的 attL 位点和目标载体的 attR 位点之间，该反应由 LR 克隆酶混合物催化，产生了两侧具有 attB 位点的目的 DNA 表达载体。

用途

Gateway 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 Gateway 技术，可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体，从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

材料与仪器

入门克隆、目标载体、TE 缓冲液、Invitrogen LR Clonase II 酶、LR Clonase II 酶、蛋白酶 K 溶液、氨苄青霉素、各种试管、离心机、涡旋仪、冰、培养皿、孔板等。

步骤

Gateway克隆（LR 反应）的操作流程如下：

1、在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合：

入门克隆 1~7 µl（50~150 ng）

目标载体 1 µl（150 ng/µl）

TE 缓冲液 8 µl，pH 8.0

冰上融化 Invitrogen LR Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 LR Clonase II 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。

2、向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl LR Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合，并离心。

3、将 LR Clonase II 酶混合物储存至 –20 ℃ 或 –80 ℃。

4、25 ℃ 下孵育 1 小时。

5、向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋后在 37 °C 条件下孵育 10 分钟。

6、进行转化：类似 BP 反应实验流程，将 1 µl 的 pUC19 DNA（10 ng/ml）反应转化进 50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞中，在含有 100 µg/ml 卡那霉素的 LB 板上分别接种 20 µl 和 100 µl。(在 LB 平板上使用针对目标载体的合适选择标记物，通常为 100 μg/ml 氨苄青霉素）。

7、预期结果：如果将整个LR反应转化并铺板，则有效的 BP 重组反应将产生>5 000 个菌落。