材料与仪器
乳腺瘤组织EDTA 异丙醇裂解缓冲液 细胞核裂解缓冲液 Triton 裂解缓冲液水浴锅 破璃棒
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂EDTA，100 mmol/L异丙醇裂解缓冲液10 mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTA150 mmol/LNaCl0.5%SDS,pH10.5NaCl，0.15mol/L 和 6mol/L细胞核裂解缓冲液75 mmol/LNaCl24 mmol/LEDTA,pH8.0蛋白酶 K 或者链霉蛋白酶，20 mg/ml。SDS,200 g/L蔗糖，lmol/LTris-HCl,2mol/L,pH9.2Triton 裂解缓冲液10mmol/LTris-HCl5 mmol/L,MgCl21%TritonX-100TE 缓冲液（lOmmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)蔗糖，pH9.2TritonX-1002. 专用设备水浴，预热到 55°C破璃棒3. 细胞和组织处理过的乳腺瘤组织（100 mg 组织用于激素受体分析）或者用 PBS 洗过 2 次的 5X105培养细胞。二、方法1. 向盛有细胞的 l0 ml 管中，加入 750ul 裂解缓冲液和 200ug 蛋白酶 K(或者链霉蛋酶);55°C 保温至少 90 min, 直到沉淀溶解。2. 如果沉淀不容解，重复步骤 1。3. 加入 250ul 6mol/LNaCl, 小心地摇动。4.4°C 离心（3000r/min)15 min。小心将上清液转移到另一新管中。5. 重复步骤 3 和 4。6. 加入等体积的异丙醇，颠倒离心管直到看见 DNA。将 DNA 缠绕到玻璃棒上，沿管壁轻轻地将 DNA 拉出，将其转移到 300ul 的 TE 或者灭菌双蒸水中。7. 放于 4°C，使其溶解。从 10 ml 血液中提取 DNA8. 加入 40 ml 预冷的（4°C)Triton 裂解缓冲液。9.4°C 放置 30 min; 每隔几分钟将管子翻转一下。10.4°C 离心（3000r/min)30 min，弃上清液。11. 用 5~15 ml0.9%(0.15mol/L) 的 NaCl 洗沉淀（细胞核）。12.2300r/min 离心 10min。13. 弃上清液。细胞核可以保存在-20°C。14. 加入 3 ml 细胞核裂解缓冲液，摇匀。15. 加入 25ul 链霉蛋白酶（20 mg/ml) 和 230ul10%SDS，室温振摇过夜。16. 加入 1ml6mol/L 的 NaCl，摇勾。17.4°C 离心（3000r/min)15 min，小心将上清液转移到另一新管中。18. 重复步骤 10。19. 加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管直到看见 DNA。将 DNA 缠绕到玻璃棒上，沿着管壁轻轻地将 DNA 拉出，将其转移到 400ul 的 TE 或者灭菌双蒸水中。20. 放于 4°C, 使其溶解。
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