常见问题和解答：Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好.因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？A：1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等１2个级别,培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。２。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。３。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。Q：请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？A：转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。现在很多代了，很稳定。Q：1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响？A：1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。２。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓１００个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着５个红球，另一次抓着１０个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。３。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。４。neo的产物是酶，过高的G４１８浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。５。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。Another answer:1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。２。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。Good answer:推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？A:G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别,培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。Q:我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？A:应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。Q:在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟，肉眼可以看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性：少量是圆形，大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁！做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？A:看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并逐渐生长，只能叫作克隆形成。我们一般在转染后24h将细胞消化下来（0.25%trypsin + 0.02%EDTA），以1：10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作（具体操作方法见附件）。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428培养液。Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗？谢谢了！A:如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行：【操作方法】（1）将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；（2）在超净台内，弃去培养皿内的培养液；（3）用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒；（有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS）（4）将24孔培养板每孔加G418选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上；（有人在细胞贴壁后再选用培养基）（5）将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37℃5%CO2培养箱培养，2-5天；（6）待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。Q:用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗？为改变这一状态，我该怎么做呢？谢谢！A:基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等；有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。
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