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I、步骤：
一、固定：
PBS 5min×3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
二、通透化：
通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
三、封闭：
封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：
一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
五、二抗孵育：
FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。
六、染核：
新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。
七、封片：
在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：
1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光(关闭室内日光灯即可)。
3、完成后最好及时镜检，照相;分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：
1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：
4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，(通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮)，定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS
3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS;或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
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